本
文
摘
要
今天推送的文章发表在Food Chemistry上的“Effect of high hydrostatic pressure on activity, thermal stability and structure of horseradish peroxidase”，通讯作者为华南农业大学食品学院的蒋卓老师。
水果和蔬菜是人类饮食中不可或缺的一部分。然而，微生物的作用、自身新陈代谢和机械损伤会导致它们的质量下降。对于新鲜的水果和蔬菜来说，酶促褐变会导致颜色的变化、风味的异味和不可避免的营养物质的减少，是果蔬在加工和贮藏过程中变质的主要原因之一。过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)催化的酚类物质氧化是影响褐变的主要因素。热处理使酶失活保证了产品的安全，但也会导致不良的营养和感官质量。
高静水压（HHP）食品加工具有灭菌效果好、温升小、风味物质保护性好等优点。作为一种非热食品加工技术，可以最大限度地保持果肉的原味和理化性质，在食品加工业中得到了广泛的应用，如杀菌、酶灭活等。高分子量分子的结构，如蛋白质和碳水化合物，可以通过HHP处理而改变。与传统的热处理工艺相比，HHP对生物活性化合物基团的保留率更高，提高了微生物的稳定性，降低了酶的活性。目前高压下POD活性变化及其结构变化的机理尚未得到广泛研究。在没有其他因素的情况下，仅靠压力很难实现POD活性的完全丧失。因为POD是一种对压力和热变性都非常稳定的蛋白质。在较低温度下，在最大程度地确保水果和蔬菜的原始特性的同时完全灭活POD仍然是一个具有挑战性的问题。
辣根过氧化物酶(HRP)是一种氧化还原酶，影响食品的褐变反应，含有308个氨基酸残基和8条碳水化合物链。每个HRP分子含有一个血红素原基团、四对二硫键和一到两个钙离子，相对分子质量约为44 kDa。在过氧化氢存在下，大多数酚类化合物都能被辣根过氧化物酶(HRP)催化生成棕色物质。为探讨HHP对HRP的作用机理，作者对压力处理前后HRP的活性和热稳定性进行了评价。采用傅立叶变换红外光谱(FTIR)、紫外-可见光谱(UV-Vis)、拉曼光谱和荧光光谱等技术分析了不同压力处理后HRP结构的变化。用透射电子显微镜和原子力显微镜观察了压力处理前后HRP分子结构的变化。
HRP剩余活力测定
HHP对HRP活性的影响如Fig. 1a所示。随着压力的增加，HRP活性不断下降。与对照组(0.1 MPa)相比，800 MPa处理后，活性降低了约36%。由于HHP作用下的酶失活机理尚未完全阐明，因此作者对HHP处理后的HRP的结构和热稳定性进行了分析。
二级结构的变化
FTIR是提供蛋白质构象信息的方法，FTIR用于表征HRP的二级结构。样品的红外光谱如Fig. 1b所示，并估算了酰胺I带(1700-1600 cm−1)。与蛋白质二级结构对应的酰胺Ⅰ带的峰分别为：β-Sheet(1610-1640 cm−1)、β-Turn(1640-1645 cm−1)、无规卷曲(1650-1660 cm−1)、α-螺旋(1661-1700 cm−1)。Table 1汇总了每个二级结构的相关内容。
对照样品(0.1 MPa)中α-螺旋含量为40.1%，无规卷曲含量为29.40%。HRP的二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲组成。与未处理样品(0.1 MPa)相比，HRP中α-螺旋的含量随压力的增加而减少，β-Sheet的含量随压力的增加而增加。β-Turn和无规卷曲含量在压力处理下没有明显变化。其原因可能是高压导致α-螺旋的一些二级键断裂并重新排列成β-Sheet结构。随着压力的增加，HRP的稳定构象转变为不稳定构象，导致HRP活性降低。
热稳定性
HRP的DSC图像如Fig. 2a所示。热变性温度(Td)和热焓(ΔH)随压力的变化如Fig. 2b所示。Td通常表示酶的热稳定性，而ΔH表示酶的有序结构的程度。未处理的对照只有一个吸热峰，ΔH和Td分别为240.2 J/g和103.74oC。随着压力的增加，ΔH的值随压力减小。当压力达到800 MPa时，ΔH和Td分别为108.5 J/g和85.78oC，表明压力处理改变了HRP的有序结构。其原因是压力处理导致HRP分子聚集，改变了三级结构。与对照组相比，HRP的Td值随压力的增加而减小，说明压力处理会导致HRP的热稳定性降低。
紫外-可见光谱分析
UV-Vis光谱是观察HRP结构变化的有效工具。Fig. 3a显示了不同压力处理后样品的UV-Vis光谱。约280 nm的吸收峰与芳香族残基周围微环境的极性相对应，被认为是蛋白质三级结构发生变化的标志。压力处理后，280 nm处的峰强度略有增加，但峰位没有明显变化。表明压力处理改变了HRP的三级结构。402 nm附近的吸收峰命名为Soret带，归因于HRP的辅助因子，即血红素的吸收。经压力处理后，402 nm附近的峰略有增强，表明此时HRP血红素基团中卟啉环的π-π*跃迁几率增加。表明压力可以诱导HRP血红素活性位点的改变，即HRP血红素中铁的氧化、自旋和配位状态是可以改变的。这也可能是酶活性下降的主要原因之一。
拉曼光谱分析
利用拉曼光谱分析了不同压力处理后HRP的构象变化。Fig. 3b显示500-570 cm− 1范围内的峰值是由半胱氨酸残基组成的S-S伸展引起的。对照样品在510 cm−1处的峰被归因于C-C-S-S-C-C键的全扭曲构象。许多天然蛋白质都符合这种二硫键，因为它的势能很低。当压力达到400 MPa以上时，在540 cm−1处出现一个新的峰。这可能是由于压力改变了二硫键的构象所致。位于535-545 cm−1的谱带被定为反式-扭曲-反式构象中的二硫键。这些变化表明，HHP将对照样品中的一些全扭曲构象改变为反式-扭曲-反式构象。S-S伸展的变化与二硫键的形成有关。这项研究表明，压力可能影响二硫键的构象，从而改变HRP活性。
880-965 nm−1的谱线对应于C-C骨架的伸缩振动。随着压力的增加，该范围内的峰明显变化，表明C-C骨架构象对压力敏感。1 003 cm−1处的峰是苯丙氨酸伸缩环。随着压力的增加，峰没有明显变化，表明该构象对压力不敏感。这反映了HHP在一定程度上改变了HRP的构象。综上所述，压力可能会影响二硫键和C-C的构象，从而改变HRP的活性。
荧光光谱分析
荧光检测被广泛用于监测蛋白质三级结构的变化。因为非极性氨基酸残基对极性蛋白质或其微环境敏感。芳香族氨基酸和荧光基团(卟啉环)可以产生特定激发波长的荧光信号。荧光光谱法可用于检测酪氨酸和色氨酸残基周围微环境的变化，这与蛋白质构象的变化相对应。还可以检查涉及氢键、范德华、疏水和静电相互作用的三级结构的构成。如Fig. 3c所示，荧光发射光谱的峰值约为430 nm(λex=330 nm)。荧光强度随着压力的增加而降低。压力处理改变了430 nm处的荧光强度，这是由于血红素的破坏引起的。血红素是HRP活性位点的修饰性基团，因此血红素的变化与HRP活性直接相关。结合紫外光谱数据，可以推断HHP可以引起HRP活性位点的改变，从而改变HRP的活性。
此外，当激发波长为280 nm时，荧光峰约为343 nm(Fig. 3d)。随着压力的增加，峰的位置没有明显变化，但荧光强度减弱。这表明蛋白质并没有完全去折叠。血红素和色氨酸残基之间的距离减小。这可能是由于高压对酶结构的压缩所致。根据荧光光谱数据推测，HRP活性的降低可能与活性中心的改变有关。
TEM分析
TEM可以直观地获得样品的形态信息，包括样品的大小、形状和聚合信息，且受样品的影响较小。用TEM观察压力处理前后HRP的结构变化。Fig. 4a和Fig. 4c分别显示了放大28 000倍和10 000倍的对照样本。在Fig. 4b和Fig. 4d中，在600 MPa下处理15 min的样品分别放大28 000倍和10 000倍。对照样品轮廓清晰，分子分布相对分散。600 MPa压力处理后，HRP分子聚集，形成大聚集体。这证实了从上述DSC和荧光实验中得出的结论，进一步表明压力会导致酶分子的聚集和酶结构的挤压。
原子力显微镜(AFM)分析
虽然TEM有一些优点，但它不能显示三维结构，如高度信息和特征地形。利用AFM在分子水平上获得高分辨率的图像，可以清晰地显示颗粒的微观结构，包括形貌、直径和高度分布。Fig. 5显示了压力处理前后HRP的AFM图像。未经处理的HRP(Fig. 5a)，用纳米分析软件计算得到的平均直径为163 nm，平均高度为1.45 nm，显示出明显的单一颗粒。在200 MPa下处理15 min后，颗粒的平均直径减小到126 nm，平均高度增加到4.6 nm。当压力继续上升到600 MPa时，颗粒聚集并形成大的聚集体。平均直径为320 nm，平均高度为11 nm。HRP分子在高压下聚集，这与TEM图像中反映的结果是一致的(Fig. 4)。压力处理后，蛋白质聚集，掩盖了酶的活性中心，阻断了与底物的结合，从而降低了酶的催化活性。
在这项研究中，作者发现HHP可以影响HRP的活性和结构以及热稳定性。HRP活性随压力的增加而降低。这是因为压力会挤压HRP的分子结构，使其聚集，进而导致二级和三级结构的一些变化。结果表明，HHP能影响HRP的活性中心，使血红素与色氨酸残基的距离不断减小，并诱导血红素中铁的氧化、自旋和配位状态的改变。此外，压力还影响二硫键和C-C的构象。DSC实验结果表明，随着压力的升高，HRP的热稳定性将继续下降。这表明在室温或低温下完全失活水果和蔬菜中的POD酶是可能的。
整理：孙骁
文章信息：
DOI：10.1016/j.foodchem.2022.132142
文章链接：
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.132142