本
文
摘
要
今天推送的文章是发表在Angewandte Chemie International Edition上的“Hydrophilicity-Based Engineering of the Active Pocket of D-Amino Acid Oxidase Leading to Highly Improved Specificity toward D-Glufosinate”，通讯作者是来自中南大学资源加工与生物工程学院的曾伟民教授。
草铵膦(2-氨基-4羟基(甲基)磷酰丁酸，C5H12NOP4 ，181.13181.13g mol-1)是一种市售的广谱、接触性、非选择性的有机磷除草剂，广泛用于许多农业和非农业系统的出苗后除草。在农业应用中，草铵膦通常被用作由外消旋混合物(分别为50%D-PPT和50%L-PPT)组成的铵盐制剂，其L-异构体可以不可逆地抑制谷氨酰胺合成酶(GS，EC 6.3.1.2)，作为谷氨酸的竞争性抑制剂，导致细胞内有毒氨的积累，光呼吸抑制，以及迅速增加的活性氧，这对杂草是致命的。由于抗草铵膦作物的出现以及草铵膦和百草枯市场的下滑，L-PPT的需求量很大，前景广阔。考虑到草铵膦的D-对映异构体（D-PPT）不具有除草活性，因此通过拆分外消旋PPT获得光学纯的L-PPT对于提高原子利用率、降低成本和环境压力具有重要意义。
D-氨基酸氧化酶(DAAO，EC 1.4.3.3)属于黄素蛋白氧化酶家族，它催化氨基酸D-异构体脱氢为亚胺基异构体，再非酶解生成α-酮酸，产生过氧化氢和氨。微生物DAAO，特别是来自酵母Rhodotorula gracilis的DAAO (RgDAAO) 和Trigonopsis variabilis(TvDAAO)，具有独特的性质，例如对某些中性或极性D-氨基酸具有高活性（所有 DAAO对酸性D-氨基酸均显示低活性），广泛的底物特异性，与辅因子 FAD 的强相互作用（与哺乳动物DAAO相比，酵母DAAO对黄素的结合亲和力高400倍以上）和良好的稳定性。DAAO可以选择性地催化PPT的二异构体转化为酮酸，2-氧代-4-[(羟基)(甲基)膦]丁酸(PPO)，这是在转氨酶或氨基酸脱氢酶存在下不对称生产L-PPT的前体(见方案1)。然而，野生型RgDAAO对非天然底物D-PPT的低酶活(<0.05U mg-1)是其在农药工业中应用的主要障碍(即使经过优化，报道的最高转化率仍低于47%)。因此，开发一种简单有效的大规模合成L-PPT对映体的方法仍然是一项具有挑战性的任务。
作为一种强大的工具，定向进化在通过提高酶的活性、选择性和其他特性来扩展酶的应用方面具有广阔的前景。与易错PCR和DNA改组不同，位点饱和突变 (SSM) 等集中诱变被广泛用于重新设计酶作为精细化学品制造中的催化剂。M. T. Reetz 等为了产生高质量的突变文库，提出了组合活性位点饱和试验（CAST）和三码饱和诱变（TCSM）方法，成功提高了环氧化物水解酶和乙醇脱氢酶的稳定性和选择性。
本研究采用底物对接和亲水性饱和取代突变策略，结合TCSM和CAST/ISM方法，对野生型RgDAAO的活性口袋进行改造，以提高其对D-PPT的特异性和活性。根据对接结果，将DAAO结合口袋周围的9个残基分为3组，并根据它们的亲水性和极性，采用含有S-T-Q的字母表进行饱和突变。通过文库的构建和筛选，获得了一个对D-PPT有较高活性的突变体(34.47U mg-1，提高了2000倍以上)。对接分析和分子动力学模拟表明，谷氨酰胺和苏氨酸在N54、M213和S335残基上的亲水性取代扩大了酶活性口袋的面积，改变了底物的构象，从而提高了对D-PPT的比活性。在此基础上，将得到的突变体应用于制备规模的D-PPT转化为PPO的催化剂。该酶具有较高的催化效率(6h转化率>49.9%)，在PPT的脱手性和L-PPT的绿色生产中具有应用前景。
首先，利用已在1.74 Å分辨率下解析的DAAO的晶体结构，通过AutoDock Vina将模型底物D-PPT对接到其结合袋中。最佳构象的结合能为+1.7 kcal/mol，表明野生型RgDAAO与D-PPT的亲和力较低。根据配体和氨基酸残基之间的距离和相互作用，选择距离底物D-PPT 4Å 以内的10个残基作为潜在的TCSM，如图1所示。由于在10个残基位点应用TCSM策略组合需要筛选多达3.14×106个转化子才能满足95%的文库覆盖率，通过降低密码子简并和三重密码子饱和诱变将大量突变位点划分为较小的位点，可以解决“智能”突变体库。因此，上述残基根据其邻近程度分为四个随机化位点：A (G52/N54/M213)、B (T56/F58/Y238)、C (Y223/I225/S335) 和D (R285)。
为了在TCSM中选择三个氨基酸作为三重密码子，作者从DAAO及其自然界中的配体D-丙氨酸和乳酸的晶体结构以及模型底物D-PPT的特性中获得了信息，D-PPT是一种亲水性非天然氨基酸。由于酶活性中心的亲水性和疏水性将极大地影响其对相应底物的比活性，因此推测DAAO活性中心的亲水残基的取代将增强其对D-PPT的特异性；考虑到大肠杆菌的亲水性、极性和密码子偏好性，选择含有丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和谷氨酰胺(Q)的三重编码作为后续的TCSM。随机位点D中的Arg285（如图1（B）所示）是DAAO的保守残基，也是20种常见氨基酸范围内亲水性最强的氨基酸。对Arg285的研究表明，它在反应过程中对底物和辅因子的定向具有重要作用，而Arg285被其他残基取代会导致催化性能下降；因此，在这项工作中，没有在Arg285上应用SM。
图1
然后在A、B 和C位点进行TCSM，文库A中的两个突变体（N54T/M213S 和 N54T/M213T）被鉴定出具有进化活性，如图2所示。其中，最好的突变体 Zn1（N54T/M213S）在图2中显示出284倍的改进。与RgDAAO-WT对D-PPT的活性相比，次优突变体Zn2 (N54T/M213T) 的活性增加了154倍。然而，在文库B和文库C中未观察到针对D-PPT的可测量活性。因此，以最佳突变体Zn1和次优突变体Zn2的基因为模板，在随机位点B和C进行下一轮筛选，采用三重密码S/T/Q。观察到明显改进的活性突变体Zn7 (N54T/M213T/S335Q) 的活性比野生型酶的活性显著增加 (>2000 倍，图 2)。结果，通过在Asn54、Met213和Ser335处替换Ser/Thr/Gln获得了具有优异反应性的突变体。整个ISM程序如方案2所示。Zn7的活性大大提高表明这些来自库A、B和C的突变的影响是累加的，而不是协同的。
方案2
图2
为了评价诱变对D-PPT酶活性的影响，测定了RgDAAO-WT和突变体Zn7的酶动力学参数以及双突变N54T/M213T模板Zn2对D-PPT的转化率。根据Michaelis-Menten方程通过非线性拟合计算了亲本酶和突变体的Km和kcat值，对D-PPT的催化效率(kcat/Km)如表1所示。由于野生型酶对底物的活性极低，因此无法测量其动力学数据。在野生型中引入双突变N54T和M213T可显著提高对底物D-PPT的催化活性(>150倍)，但突变体的Km值(79.81 mM)太高，表明其对底物的亲和力较低。因此推测高周转数(kcat，31.21s-)1 和kcat/Km值(24.21min-1mm-1)是突变株Zn7对D-PPT酶活性提高的关键因素。
虽然RgDAAO-WT对不同类型的底物表现出几乎完全不同的催化性能，但工程RgDAAO突变体的底物范围也进行了测试。根据D-氨基酸的极性和亲水性将其分为三类，并测定了RgDAAO-WT和Zn7对这些底物的比活性(表2)。结果表明，在所有的21例中有17例对大多数D-氨基酸底物具有中等到极好的催化活性(从约10U/mg到约200U/mg)，而野生型酶对其中的许多底物如S1、S11、S12、S16-S21不催化，活性<5U/mg，表明N54、M213和S335的三重诱变对RgDAA0酶的底物范围有积极的影响。
对于基团I，RgDAAO-Zn7对底物S1-S9的催化活性与RgDAAO-WT相似，都是具有非极性侧链的疏水氨基酸，并且两种酶的最高活性都是在蛋氨酸上确定的，这表明亲水性-取代饱和突变策略在催化疏水底物时对酶的影响有限。对于第II组中的S11、S13-S15这类亲水性的含极性侧链的化合物，Zn7的催化活性提高了2倍以上，尤其是对谷氨酰胺(S15)，Zn7的催化活性比RgDAAO-WT提高了约5倍。然而，这两种酶都没有表现出对半胱氨酸(S12)的任何可识别的活性，半胱氨酸的侧链上有-SH基团。第三类底物S16-S20为带电荷的亲水性氨基酸，起始酶活性<5U/mg，未检测到或有微量活性。与WT相比，除S18外，Zn7对这两种底物表现出很好的活性，尤其是对酸性氨基酸S16和S17，Zn7对这两种底物的活性提高了100倍以上(S17的315倍)。本工作中的目标底物D-草铵膦是一种谷氨酸的类似物，它不能被RgDAAO-WT催化，但可以被工程变种Zn7转化为相应的α-酮酸，催化效率很高。上述结果表明，在RgDAAO的活性口袋中引入亲水残基可以导致对亲水底物的催化效率发生显著变化。
为了深入了解三重突变与底物结合的关系，应用SWISS-MODEL服务器，以RgDAAO的晶体结构(PDB：1C0K，序列同源性99.1%，覆盖率98%)为模板，应用SWISS-MODEL服务器重建了突变体ZN7的同源模型，并用SAVE V6.0中的Procheck和Verify 3D程序进行了评估。重建模型的质量满足后续分析的要求，因为99.45%的残基显示出平均3D-1D得分大于0.2，89.4%的残基位于最有利的区域。由于残基D218远离酶的活性中心，它出现在Ramachandran曲线图中的不利区域并不影响模型的准确性。然后应用GROMOS96 43a1力场对模型进行10 ns的动态模拟优化，提取蛋白质构象的最后一帧用于后续分析。经过除水和加氢制备后，底物D-PPT使用默认选项对接到亲本酶和突变体锌的结合口袋中，具有最低能量的酶底物络合物的构象如图3所示。
Zn7与D-PPT的对接结果显示，与野生型酶相比，结合能降低(-4.8 kcal/mol，比野生型低6.5 kcal/mol)，这表明Zn7与D-PPT的亲和力增加，尽管它有很高的Km(73.52 mM，如前所述)。RgDAAO-WT和RgDAAO-Zn7(N54T/M213T/S335Q)的结构比较表明，N54T的突变干扰了Asn54的氨基和D-PPT的羟基之间的氢键的发展，而D-PPT的氨基和FAD的黄素基之间新形成的氢键使底物与辅因子相互作用成为可能(图3(C))。然而，M213的空间位阻阻止了D-PPT的取向改变和D-PPT与FAD之间氢键的形成(图3(A))；这一结果可以解释为什么文库A中的单个突变体N54T在实验部分无效。因此，N54T/M213T或N54T/M213S的双突变导致辅因子FAD与D-PPT的氨基之间形成新的氢键，从而更容易启动氢化物从α-氨基转移到黄素，从而显示出对D-PPT的活性增强。此外，S335Q的突变导致D-PPT的磷酰基与骨架Gln残基旁边的Tyr238的羟基之间形成新的氢键，可能参与D-PPT锚定到活性中心。还观察到D-PPT和Tyr238之间的氢键长度增加(从2.3增加到2.6 Å)，这可能是由于在S335处取代了更大的残基Gln，这扩大了底物的面积，从而允许D-PPT的分子取向改变，使以Cβ和Cγ之间的键为旋转轴的氨基和羧基的构象旋转180°(图3(A))。D-PPT构象的变化表明，N54、Met213和S335被亲水性的块状Thr或Gln取代，在底物结合和氧化反应中发挥了重要作用，推测这是残基54/335的亲水性/范德华力和残基213的空间位阻的结果。
图3
N54、M213和S335上的S/T/Q替换也改变了酶的结合口袋，如图4所示。RgDAAO-WT复合体的活性口袋太窄，D-PPT无法进入(图4(A))，从而阻碍了辅因子与底物之间的接触，中断了酶反应，导致活性极低(0.0163 u mg-1)。相反，残基M213和S335上的谷氨酰胺和苏氨酸的取代扩大了Zn7的活性口袋并允许底物进入(图4(B))，这有助于提高对D-PPT的比活性。此外，为了进一步阐明氧化活性的提高与酶活性口袋的重建之间的关系，分别对RgDAAO-WT和RgDAAO-Zn7与D-PPT的络合物进行了100 ns的MD模拟。计算了RgDAAO-WT和RgDAAO-Zn7的MD模拟的RMSD和RMSF值(图4(C)和(D))，系统在100 ns内逐渐达到平衡，结果表明，三个突变点的修改增强了突变体RgDAAO-Zn7的稳定性(RMSD为3.99 Å，而野生型为4.31 Å)。Cα原子的波动也表明，突变的Zn7在蛋白质表面的第85、102和128位残基附近(RMSF分别从2.965降到1.765、从3.316降到2.047、从3.889降到1.317)的柔韧性降低。这些分析表明，本工作中对RgDAAO-Zn7结合口袋的修饰提高了内部相互作用的稳定性，并可以解释突变体催化能力的极大提高。这些酶-底物对接分析表明，这三个残基N54、M213和S335参与了RgDAAO的稳定性和催化行为，进一步证明了三个突变株N54T/M213T/S335Q在酶活性方面具有良好的协同效应。
图4
为了评价RgDAAO-WT和RgDAAO-Zn7对商品PPT去消旋化的实际催化性能，以非天然氨基酸D，L-PPT为原料，在制备规模(100mL)中进行氧化脱氨反应制备PPO，并用高效液相色谱仪对产物进行了测定。如图5所示，100 mM D，L-PPT在5g/L湿菌体条件下可在6h内转化为PPO，转化率为49.9%，而以RgDAAO-WT为催化剂，48h转化率仅为7%，这主要是由于其对D-PPT的活性较低所致。此外，为了考察Zn7的催化性能，在反应液中加入不同浓度的底物，过氧化氢酶的用量也按相同比例增加。如图5所示，突变株Zn7能够在20h内将300 mM底物D，L-PPT(39.63gL-1)转化为26.16gL-1的PPO，转化率为44%；即使在较高的底物浓度下，使用相同数量的酶(5g/L湿细胞)，它仍然可以表现出高的转化率(500 mM，30h内40%)。当底物浓度分别为100、200、500 mM时，PPO的空间−时间产率分别达到39.90、31.39和31.72g L−1d−1。RgDAAO-Zn7的优异催化性能使PPO的生产效率比RgDAAO-WT提高了58倍。这些结果表明，该工程菌株在D，L-PPT的酶促去消旋化和农药工业中L-PPT的不对称合成方面显示出巨大的潜力。
图5
1 -END-
文章信息：
PMID: 36151587
DOI: 10.1002/anie.202212720
