微生物实验室主要是做哪些工作内容（微生物实验室做哪些实验）

观察微生物主要有两种方式，一种是培养之后观察菌落特征，另一种是通过显微镜观察。

1.微生物培养

微生物的培养根据培养过程中是是否有氧气可以分为需氧培养和厌氧培养，微生物培养过程中的培养基也可以分为普通培养基和功能培养基

1.1需氧培养

大多数的细菌、放线菌、霉菌培养法均为需氧培养。培养基接种微生物后放于35 ℃~37 ℃或25℃恒温培养箱(或水浴箱)中，培养18 h-24h或3d-5d,大多数菌能看到明显的菌落，可以进行计数及鉴定。需氧培养法按培养基的状态来分，可分为三类。固体培养法是指将微生物接种在固体培养基上生长繁殖的方法，固体培养基包括琼脂平板和琼脂斜面。琼脂平板用于菌落计数和分离菌落和菌落形态观察，琼脂斜面用于保藏。液体培养法是利用液体培养基对微生物进行培养的方法，用于菌种的选育及生化试验和发酵试验等。利用半固体培养基进行培养的方法，半固体培养基含有一定的琼脂(0.02%-0.3% )，使培养基有一定的黏度，但没有完全固化。培养时，盛半固体培养基的试管放置于试管架上，然后置于培养箱中进行培养。一般用于生化试验，可用于判别微生物的运动性。

1.2厌氧培养

指把微生物置于与分子态氧隔绝状态下所进行的培养。专性厌氧细菌不这样培养就不能生长发育，但在实验条件下，有时也把兼性厌氧细菌也进行这样培养。由于目的不同而有种种培养方法，可分为以下几大类：

（ 1）与空气隔绝或尽量少接触空气的培养法：在三角瓶瓶颈以下装满液体培养基，通过煮沸把溶解的空气赶出后，立即冷却进行细菌接种。由于发酵而产生 H2 和 CO2 时，就可进一步确认是厌氧细菌。另外，把琼脂培养基加入普通试管约 10厘米高度进行穿刺培养，或移植于液体培养基和固体斜面培养基上以后，再加一层液体石腊或矿物油，用这些方法可防止与空气接触。

（ 2）除掉空气的方法：把微生物装入耐压容器中进行真空培养，或充满二氧化碳、氢气、氮气、氩气等。这些气体可把事先混入的微量氧气除掉。在氢存在时，可用置换后飞溅火花等方法来除掉残存的氧气

（ 3）去氧的方法：使用碱性邻苯 三酚（ pyrogallol） 、黄磷、金属铬和稀硫酸进行化学除氧，或使用好氧细菌及发芽的种子，使通过呼吸而消耗掉氧气。

（ 4）在培养基中加入还原剂（如 0.1%的巯基乙酸钠盐， 0.01%的硫化钠等）。以上各种方法进行适当组合就能进一步确认厌氧细菌。为了确定厌氧性，可在碱性条件下加入葡萄糖并加热，与配制的还原型次甲蓝（美蓝）溶液一起加入，保持脱色状态即可。

1.3培养基

培养基是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素，用于各种微生物培养和鉴定。

一般基础培养基中含有蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸膏、氯化钠、琼脂等基本营养万分。一些选择、鉴定培养基根据用途不同，则需加入抑菌剂、指示剂、血液、糖等试剂，以利于需要菌的生长与鉴别。一些需要使细菌大量生长、繁殖的培养基，主要成分多为氨基酸、核苷酸、无机盐、生长因子等。

选择性培养基：一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。

鉴别培养基：一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。例如，伊红美蓝乳糖培养基（EMB）。

2.显微镜观察及染色

除了上面经过微生物培养过程的形态观察和生理生化特征来研究微生物外，通过对微生物进行不同的染色处理后通过纤维镜观察也是研究微生物的重要手段，其中普通的光学显微镜应用最广泛。

由于微生物细胞含有大量水分（一般在80~90%以上），对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的明暗差。所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。

1.染色的基本原理

微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生地各种化学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样，碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力，易于吸附。但是，要使酸性物质染上酸性材料，必须把它们的物理形式加以改变（如改变pH值），才利于吸附作用的发生。相反，碱性物质（如细胞质）通常仅能染上酸性染料，若把它们变为适宜的物理形式，也同样能与碱性染料发生吸附作用。

细菌的等电点较低，pH值大约在2~5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。

影响染色的其它因素，还有菌体细胞的构造和其外膜的通透性，如细胞膜的通透性、膜孔的大小和细胞结构完整与否，在染色上都起一定作用。此外，培养基的组成、菌令、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等，也都能影响细菌的染色。

2.染料的种类和选择

染料分为天然染料和人工染料两种。天然染料有胭脂虫红、地衣素、石蕊和苏木素等，它们多从植物体中提取得到，其成分复杂，有些至今还未搞清楚。目前主要采用人工染料，也称煤焦油染料，多从煤焦油中提取获得，是苯的衍生物。多数染料为带色的有机酸或碱类，难溶于水，而易溶于有机溶剂中。为使它们易溶于水，通常制成盐类。

染料可按其电离后染料离子所带电荷的性质，分为酸性染料、碱性染料、中性（复合）染料和单纯染料四大类。

2.1酸性染料

这类染料电离后染料离子带负电，如伊红、刚果红、藻红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等，可与碱性物质结合成盐。当培养基因糖类分解产酸使pH值下降时，细菌所带的正电荷增加，这时选择酸性染料，易被染色。

2.2碱性染料

这类染料电离后染料离子带正电，可与酸性物质结合成盐。微生物实验室一般常用的碱性染料有美兰、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿和蕃红等，在一般的情况下，细菌易被碱性染料染色。

2.3中性（复合）染料

酸性染料与碱性染料的结合物叫做中性（复合）染料，如瑞脱氏（Wright）染料和基姆萨氏（Gimsa）染料等，后者常用于细胞核的染色。

2.4单纯染料

这类染料的化学亲和力低，不能和被染的物质生成盐，其染色能力视其是否溶于被染物而定，因为它们大多数都属于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如紫丹类（Sudanb）的染料。

3.制片和染色的基本程序

微生物的染色方法很多，各种方法应用的染料也不尽相同，但是一般染色都要通过制片及一套染色操作程序。

3.1制片

在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水，用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层，为避免因菌数过多聚成集团，不利观察个体形态，可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层，若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液，则直接涂布于载玻片上即可。

3.2干燥

涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

3.3固定

　　标本干燥后即进行固定，固定的目的有三个：

1）杀死微生物，固定细胞结构。

2）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。

3）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。

固定常常利用高温，手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3~4次，共约2~3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色。

以上这种固定法在微生物实验室中虽然应用较多普遍，但是应当指出，在研究微生物细胞结构时不适用，应采用化学固定法。化学固定法最常用的固定剂有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1~2%的饿酸等。饿酸能很快固定细胞但不改变其结构，故较常用。应用饿酸固定细胞的技术如下：在培养皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛细管，在毛细管中注入少量的1~2%饿酸溶液，同时在玻璃上再放置湿标本涂片的载玻片，然后把培养皿盖上，经过1~2分钟后把标本从培养皿中取出，并使之干燥。

3.4染色

标本固定后，滴加染色液。染色的时间各不相同，视标本与染料的性质而定，有时染色时还要加热。染料作用标本的时间平均约1~3分钟，而所有的染色时间内，整个涂片（或有标本的部分）应该浸在染料之中。

若作复合染色，在媒染处理时，媒染剂与染料形成不溶性化合物，可增加染料和细菌的亲和力。一般固定后媒染，但也可以结合固定或染色同时进行。

3.5脱色

用醇类或酸类处理染色的细胞，使之脱色。可检查染料与细胞结合的稳定程度，鉴别不同种类的细菌。常用的脱色剂是95%酒精和3%盐酸溶液。

3.6复染

脱色后再用一种染色剂进行染色，与不被脱色部位形成鲜明的对照，便于观察。革氏染色在酒精脱色后用番红，石碳酸复红最后进行染色，就是复染。

3.7水洗

染色到一定的时候，用细小的水流从标本的背面把多余的染料冲洗掉，被菌体吸附的染料则保留。

3.8干燥

着色标本洗净后，将标本晾干，或用吸水纸把多余的水吸去，然后晾干或微热烘干，用吸水纸时，切勿使载玻片翻转，以免将菌体擦掉。

3.9镜检

干燥后的标本可用显微镜观察。

综上所述，染色的基本程序如下：

　　制片→固定→媒染→染色→脱色→复染→水洗→干燥→镜检。

4.染色方法

4.1简单染色法

利用单一染料对细菌进行染色，适用于一般形态的观测，重用碱性染料简单染色。流程为：涂片-干燥-固定-染色-水洗-干燥-镜检。常用染料为碱性美蓝染液或石碳酸复红染液。

4.2复染色法

用两种或两种以上不同染料可将细菌染成不同的颜色，除可观察细菌的大小、形态与排列外，还反应出细菌染色特性，具有鉴别细菌种类的价值。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。

4.2.1革兰氏染色法

（1）原理：

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔隙缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红染液复染后呈红色。

（2）染色步骤

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

1）载玻片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。

2）草酸铵结晶紫染1分钟。

3）自来水冲洗，去掉浮色。

4) 用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。

5）用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。酒精脱色为整个流程最关键的一步。

6）用蕃红染液或者沙黄复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。

4.2.2抗酸染色法acid－fast staining method

（1）原理：

分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。

（2）染色步骤

1）初染

用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。

2）脱色 3%盐酸酒精脱色30秒~1分钟；用水冲洗。

3）复染 用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察。

4.3特殊染色法

4.3.1鞭毛染色

（1）原理：

细菌的鞭毛极细，直径一般为10~20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂(如单宁酸或明矾钾)处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色（如碱性复红、硝酸银、结晶紫）。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。目前，细菌鞭毛染色方法根据染色剂的不同，可分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法、镀银染色法和荧光蛋白染色法6类，前5类方法的媒染剂成分中均含有单宁酸。

（2）染色步骤

1)菌种用新培养的菌种为宜，如所用菌种已长期未移种，则用新制备的斜面连续移种2~3次后再使用。最好是将经活化的菌种接种到新制备的琼脂斜面或半固体培养基平皿上，培养10小时左右，备用。

2)制片 在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取少许备用的菌苔，最好从菌落的边缘取菌苔，注意不要挑上培养基，在载玻片的水滴中轻沾几下。将载玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。

3)染色 涂片干燥后滴加A液染3~5分钟，用蒸馏水冲洗，或将残水沥干或用B液冲去残水（注意：一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景很脏）。洗净A液滴加B液后，将玻片在酒精灯上稍加热，使其微冒蒸汽且不干，一般染30~60秒钟。然后用蒸馏水冲洗，自然干燥。

4)镜检 镜检时，如未见鞭毛，应在整个涂片上多找几个视野，有时只在部分涂片上染出鞭毛。菌体为深褐色，鞭毛为褐色。

细菌鞭毛染色要求非常小心细致，染色成功的关键主要决定于：(a)菌种活化的情况，即要连续移种几次；(b)菌龄要合适，一般在幼龄时鞭毛情况最好，易于染色；(c)新鲜的染色液；(d)载玻片要求干净无油污。

（改良Ryu法）：

①玻片的处理 将新载玻片浸泡在95%乙醇中。临用时取出，以干净纱布擦干。②在玻片上滴蒸馏水1滴。③挑取培养物少许，轻触蒸馏水滴顶部，仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1~2 min轻轻水洗。⑤干后显微镜镜检观察结果 鞭毛和菌体呈紫色。

4.3.2异染颗粒染色(阿尔培托法)

①细菌涂片经火焰固定，加甲液染色3~5min。水洗。②滴加乙液，染1min。水洗。③干后显微镜镜检观察结果 菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色,用于白喉棒状杆菌染色。

甲液：甲苯胺兰 0.15g 孔雀绿 0.2g 乙液：碘 2g 碘化钾 3g

4.3.3荚膜染色：

（1）原理：

荚膜是位于细胞壁表面的一层松散的粘液或胶状物质，主要是由葡萄糖与葡萄糖醛酸组成的聚合物，也有含多肽与脂质，含水分多，疏松且较薄，受热易失水变形。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色，热切可溶于水，易在用水冲洗时被除去，故常用衬托染色法，即将菌体着色再使背景着色，而将不着色的透明荚膜衬托出来。

（2）染色步骤

方法1：黑斯荚膜染色法

1）在荚膜菌涂片上（在空气中 自然干燥，无需加热固定）放一小块滤纸片，之后滴加结晶紫染液。

2）在火焰上微微加热，使玻片上染液 冒蒸汽为止。

3）用200g/l硫酸铜水溶液冲洗染液，切勿用流水冲洗。用吸水纸吸干后油镜检查。

结果：菌体呈紫色，荚膜呈淡紫色或无色。

方法2：密尔荚膜染色法

1）制片。常规法制片，干后加热固定。

2）染色。加石炭酸复红液。微加热染1min，水洗。

3）媒染。加特殊媒染剂，作用0.5min，水洗。

4）复染。加碱性美蓝液，染1min，水洗。

5）镜检。干后油镜检查。

结果：菌体呈鲜红色，荚膜呈蓝色。

方法3：奥尔特荚膜染色法

涂片、自然干燥、火焰 固定后滴加染液，经火焰加温使染液产生蒸汽后，继续染3min，水洗，待干，镜检。

结果：菌体呈赤褐色，荚膜呈黄色。

方法4：湿墨水负染法

1）加一滴墨水于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其混合均匀。

2）将一洁净盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。加盖玻片时勿产生气泡，以免影响观察。

3）高倍镜或油镜检查。

结果：背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈。

方法5：干墨水负染法

1）加一滴60g/l葡萄糖液于洁净载玻片的一端，然后挑取少量菌体与其混合，再加一环墨水，充分混匀。

2）另取一端边缘光滑的载玻片作推片，将推片一端的边缘置于混合液前方，然后稍向后拉，当推片与混合液接触后，轻轻左右移动，使之沿推片接触的后缘散开，尔后以大约30°角迅速将混合液推 向玻片另一端，使混合液铺成薄层。

3）空气中自然干燥 。

4）用甲醇浸没涂片固定1min，弃去 甲醇。

5）在酒精灯上方用文火干燥 。

6）用甲基紫染1~2min。

7）用自来水轻轻冲洗，自然干燥 。

8）高倍镜或油镜检查。

结果：背景灰色，菌体紫色，菌体周围为清晰透明的荚膜。

方法6：石炭酸复红液染色法

1）取培养了72h的荚膜菌制成涂片，自然干燥（不可用火焰烘干）。

2）滴加1~2滴95%酒精固定（不可加热固定）。

3）加石炭酸复红染液染色1~2min，水洗，自然干燥 。

4）在载玻片一端加一滴墨水，用一块边缘光滑的载玻片与墨水接触，再以匀速推向另端，涂成均匀的一薄层，自然干燥 。

5）干燥后用油镜观察。

结果：菌体红色，荚膜无色，背景黑色。

4.3.4芽孢染色

（1）原理

芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。

（2）染色步骤

方法1：

1）将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。

2）滴加3~5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。

3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4~5分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6％）染10分钟。

4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。

5）用番红水溶液复染1分钟，水洗。

6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。

方法2：

1）取二支洁净的小试管，分别加入0．2ml无菌水，再往一管中加入1~2接种环的蜡状芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入1~2接种环的生孢梭菌的菌苔，两管各自充分混合成浓厚的菌悬液。

2）在菌悬液中分别加入0．2ml苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热3~5分钟。

3）用接种环分别取上述混合液2~3环于两片载玻片上，涂薄，风干后，将载玻片稍倾斜于烧杯上，用95％乙醇冲洗至无红色液流出。

4）再用自来水冲洗，滤纸吸干。

5）取1~2接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然干燥后，油镜观察，在淡紫灰色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。