本
文
摘
要
水霉菌的菌丝体都是长管状而没有隔膜的菌丝，含有许多细胞核，大部分都是腐生菌，生活在水中的腐烂植物体及昆虫的尸体上;有极少数菌类能寄生在活鱼身体上。细胞壁中含有聚葡萄糖及纤维素。无性生殖时可以生成棍棒状的孢子囊;囊中分裂成许多单核游孢子﹝不经减数分裂﹞;游孢子具有两条不等长的鞭毛，其中一条较短的鞭毛上有两列绒毛在游动时指向前方;较长的一条鞭毛却指向后方。游孢子在游动一个时期后，就会收回鞭毛;孢子变成圆球形，生出细胞壁;如能沉到适当的基质上，就发芽生出芽管，而长成一株新植物。如果营养环境不良，这枚圆球形的细胞会再放出一枚新的游孢子。此种再生游孢子的形状为肾脏形，且在侧面生有两条不等长的鞭毛 ;其中较短的一条，依旧属于羽毛状，而且在游动时指向前方。因此，水霉菌的游孢子就有两种型式。水霉菌有性生殖时，分枝先端发生隔膜，形成球形的卵胞 ; 最初，卵胞中有许多细胞核，可是后来大部分都退化消失;于是细胞质就分别集中，围绕在剩馀的各细胞核周围，形成一些 *** 的卵细胞(或叫卵球);所以每一个卵胞中所含有的卵细胞数，都有多有少而不相等。另一方面，精胞中虽也具有许多细胞核，但却不再分隔个别的雄性细胞 ;而是把整个精胞依向化性运动而弯向卵胞，并且伸出多条分枝或不分枝的受精管，把每一个雄核送到卵细胞内，把雄核排出而与雌核相结合。受精后，每一枚受精卵变成一个囊胞接合子(也就是卵孢子)，具有厚壁，能抵抗其他微生物的侵害。接合子在经过一个休眠期以后，就发芽而进行减数分裂，形成一个芽管(最初只有4枚细胞核，后来就分裂成许多细胞核) ; 不久就会在芽管上生成孢子囊。水霉菌属于雌雄同株。 1、传代保存法:有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的 浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。 一般地，大 多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如:①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传性状容易发生变异;③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物 质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种，工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。 2、液体石蜡覆盖保存法:该法较前一种 方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方 法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌 等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。 3、载体保存法:即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种，如 ①土壤保存法:主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在 室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是:取适量土壤(5克)置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜)，然后高压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种，培养 至菌丝能用肉眼确认的程度为止，移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封，冷藏或室温保存。 ②砂土保存法:取清洁的砂，筛去掉大砂 粒，并用磁铁吸去砂中铁屑，再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗数次，干燥后，置于试管或安瓶管中保持2~3cm深，再经干热灭菌后，加入1ml菌种培养液，经充分混匀后，放入真空干燥器中，完全干燥后熔封保存。也可用二份洗净的砂(经HCl预处理)和一份贫瘠、过筛的黄土搀和后灭菌，再进 行菌种保藏。 ③硅胶保存法:以6~16目的无色硅胶代替砂子，干热灭菌后，加入菌液。加菌液时，由于硅胶的吸附热常使温度升高，因而需设法加以冷却。④磁珠保存法:将菌液浸入素烧磁珠(或多孔玻璃珠)后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶(或无水CaSO4)，上铺玻璃 棉，再放上10~20粒磁珠，经干热灭菌后，接入菌悬液，最后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很有效，特别适用于根瘤菌，可保存长达两 年半时间。 ⑤麸皮保存法:在麸皮内加入60%的水，经灭菌后接种培养，最后干燥保藏。 ⑥纸片(滤纸)保存法:将灭菌纸片浸入培养液或菌悬液中，常压或减压干燥后，置于装有干燥剂的容器内进行保存。 4、悬液保存法:即使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法。常用的有， ①蒸馏水保存法:适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌，将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。 ②糖液保存法:适用于酵母菌，如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗处保存，可长达10年。除此之外，也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。 5、寄主保存法:即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。 6、冷冻保存法:适用于抗冻力强的微生物。这些微生物可在其菌体细胞外遭受冻结的情况下而不受损伤，而对其它大多数微生物而言，无论在细胞外冻结还是在细胞内冻结，都会对菌体造成损伤，因此当采用这种保藏方法时，应注意以下几点， ①要选择适于冷冻干燥的菌龄细胞; ②要选择适宜的培养基，因为某些微生物对冷冻的抵抗力，常随培养基成分的变化而显示出巨大差异; ③要选择合适的菌液浓度，通常菌液浓度越高，生存率越高，保存期也越长; ④最好在菌液内不添加电解质(如食盐等); ⑤可在菌液内添加甘油等保护剂，以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象。同样，也可添加各种糖类、去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好保护效果的溶剂，但对有些微生物而言，不加保护剂时更有效。 ⑥原则上应尽快进行冷冻处理，但当加入保护剂时，可静置一段时间后再进行处理。 ⑦就动物细胞而言，应在-20℃范围内以1℃/min左右的速度缓慢降温，此后必须尽快降到贮藏温度;而对绝大多数微生物而言，则不必如此，如结构较为复杂的原虫则可在-35℃范围内进行缓慢降温，而噬菌体则必需采用上述的二阶段法进行冷冻; ⑧若进行长期保存，则贮藏温度越低越好; ⑨取用冷冻保存的菌种时，应采取速融措施，即在35~40℃温水中轻轻振荡使之迅速融解。而就厌氧菌来说，则应选择静置融化的措施。当冷冻菌融化后，应尽量避免再次冷冻，否则菌体的存活率将显著下降。 常用的冷冻保存法包括:①低温冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃):低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便，也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多，有些可添加保护剂。此外，也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器内，再放入低温冰箱内进行保存的。 ②干冰保存法(-70℃左右):即将菌种管插入干冰内，再置于冰箱内进行冷冻保存。 ③液氮保存法(-196℃):是适用范围最广的微生物保存法。其操作步骤如下， a、装安瓶管:使用尽量浓厚的菌体悬浮于含有适当防冻剂(保存霉菌不用防冻剂)的灭菌溶液中，将0.2~1ml的这种溶液分装于安瓶中，或在装有分散剂的安瓶中直接接种，或将菌丝体琼脂块直接悬浮于分散剂中。 b、熔封安瓶管:若直接贮存于气相液氮中(-150℃~-170℃)时，则不需熔封。 c、检查安瓶管是否熔封良好:即在4℃下，将熔封安瓶管在适当的色素溶液中浸泡2~30分钟后，观察有无色素进入安瓶。 d、缓慢冷却:将熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮气以约1℃/min的速度冷却至-25℃左右，也可在-20℃~-25℃的冰箱内缓慢冷却30~60min。 e、速冷:最后浸入液氮中快速冷却至-196℃。 7、冷冻干燥保存法:其原理是首先将微生物冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分。事实上，从菌体中除去大部分水分后，细胞的生理活动就会停止，因此 可以达到长期维持生命状态的目的。该方法适用于绝大多数微生物菌种(包括噬菌体和立克次氏体等)的保存。在进行冷冻干燥时，需注意以下几个问题:a、冷冻干燥前的培养条件:首先检验菌种纯度。一般地说，将待保存的微生物在营养丰富且容易增菌的培养基上进行培养为宜;菌龄以达到对数生长期为好;若 为有芽孢或孢子的微生物，则以芽孢和孢子形成以后进行保存为好;菌液浓度以高为好，如细菌应达到109~1010/ml。 b、菌株号码等的标记:可在安瓶外侧标记或在安瓶内封入标签。 c、安瓶的准备:将安瓶在2%HCl中浸泡过夜，自来水冲洗3次后，蒸馏水刷净，干燥，塞棉塞，贴标签，干热灭菌或温热灭菌后，60℃恒温干燥。8、甘油管保藏法:在5ml菌种保藏管中，将等体积的菌悬液和40%的甘油充分混匀后，于-20℃冰箱中保存。
