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文
摘
要
关于抗生素
抗生素是一组用于抑制微生物生长或者杀死微生物的药物，一般用来抑制感染，例如我们生活中十分熟悉的青霉素、红霉素、头孢菌素等等就是典型的抗生素。抗生素的发现大大改善了炎症和感染，但是由于细菌变得越来越聪明，问题也随之而来，那就是抗生素的耐药性。
图 1. 抗生素按照作用机制分类[1]转染与抗生素筛选
转染 (Transfection) 是真核细胞主动或被动导入外源核酸片段而获得新表型的过程，引入的遗传物质 (DNA 和 RNA) 稳定或暂时存在于细胞中，据此，转染可分为稳定转染和瞬时转染。
稳定转染：引入的遗传物质常带选择性标记基因，它们被整合到宿主的基因组中，即使在宿主细胞分裂传代后也能维持转基因的表达。即稳转的细胞系通过一些选择性标记反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
瞬时转染：引入的遗传物质仅在有限的时间内表达，并且不会整合到基因组中。遗传物质也会因环境因素和细胞分裂而丢失，瞬时转染维持时间较短，需尽快在蛋白或基因水平进行相应的检测。
图 2. 两种不同的转染方式[4]A. 稳定转染; B. 瞬时转染关于抗生素抗性筛选：携带抗生素抗性标记的载体进入细胞，转染成功的细胞在含有抗生素的选择培养基中生长，而不带有抗性基因的细胞会被抗生素杀死，最后获得稳定的带抗性细胞株。因此，抗生素抗性标记是区分稳定转染和瞬时转染的有效方法。 在原核/真核生物转染实验中常用的抗生素有很多，例如嘌呤霉素、G418、卡那霉素、四环素和博来霉素等等。
■ 嘌呤霉素 (Puromycin)
嘌呤霉素是一种氨基核苷类抗生素，是真核和原核生物中蛋白质翻译的有效抑制剂。如图 3 所示，嘌呤霉素通过模拟氨酰化 tRNA (aa-tRNA) 的 3 末端，代替正常氨基酸参与翻译延长过程。它通过核糖体肽基转移酶中心 (PTC) 催化掺入新生链的 C 末端，阻止进一步延伸，导致翻译过早的终止，从而抑制了蛋白质合成。
图 3. 嘌呤霉素的作用机制[6]编码嘌呤霉素抗性的基因——嘌呤霉素 N-乙酰转移酶 (PAC) 的 pac 基因，是从 Streptomyces alboniger 中分离出来的，早在 1988 年，PAC 就首次被用作分离稳定转染的哺乳动物细胞系的显性选择标记。
Mikołaj Słabicki 等在 Nature 上发表的 Small-molecule-induced polymerization triggers degradation of BCL6 中使用嘌呤霉素筛选抗性的 HEK293TCas9 细胞。首先将 HEK293TCas9 细胞进行慢病毒转染，然后再用嘌呤霉素孵育进行筛选。因低浓度的嘌呤霉素对活细胞具有毒性，所以筛选后存活下来的细胞即具有嘌呤霉素抗性。Yunhao Chen 等在 Mol Cancer 上发表的 WTAP facilitates progression of hepatocellular carcinoma via m6A-HuR-dependent epigenetic silencing of ETS1 中，也是选取了 4 个细胞系，在用慢病毒转染后，用嘌呤霉素感染细胞 1 周或更长时间，通过 RT-qPCR 和 WB 分析确定转染的效率。
图 4. 嘌呤霉素抗性细胞筛选过程■ G418
G418，一种氨基糖苷类抗生素，由细菌 Micro-monospora rhodorangea 产生，其结构与新霉素、庆大霉素
和卡那霉素类似。G418 的抗性是由来自 Tn5 的编码氨基糖苷 3-磷酸转移酶 APH 3 II 的新霉素抗性基因 (neo) 介导的。与只对原核生物有作用的新霉素不同，G418 对细菌、酵母、原生动物、蠕虫和哺乳动物细胞均具有广泛的毒性。G418 与细胞中的 70S 或者 80S 核糖体进行不可逆的结合，抑制蛋白质延伸，进而阻断了多肽的合成。
图 5. G418 抗性细胞筛选过程[14]注: 只有经转座子 Tn5 或 Tn601 的 neo 基因转染的细胞可获得对 G418 的抗性；G418 的有效浓度因细胞的生长培养基、培养条件和代谢率而异。
■ 卡那霉素 (Bekanamycin)
卡那霉素，一种广谱氨基糖苷类抗生素，可以从细菌 Streptomyces kanamyceticus 中分离出来。卡那霉素与 30S 核糖体亚基中的 16S rRNA 受体不可逆结合后，会影响 mRNA 密码子向氨基酸的翻译，引起 mRNA 的误读或易位抑制，从而抑制蛋白质合成(图 6B)。
图 6. 卡那霉素的作用机制[17] A: 核糖体中的正常翻译过程; B: 卡那霉素 (K) 影响翻译过程■ 四环素 (Tetracycline)
四环素，是一种广谱的抗生素，对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、非典型生物如衣原体、支原体和立克次体以及原生动物寄生虫具有活性。如图 7，四环素与细菌核糖体的 30S 亚基可逆结合，抑制氨酰-tRNA 与 mRNA-核糖体复合物的结合，即防止任何进入的氨酰基-tRNA 被信使 RNA 中的密码子识别，从而抑制蛋白质的合成。
对四环素的抗性是通过以下几种机制之一介导的：四环素流出、通过将特定细胞质蛋白与核糖体结合来保护四环素结合位点、四环素修饰或在四环素结合位点处对 16S rRNA 进行修饰。
图 7. 四环素在核糖 *** 点结合并阻断 tRNA 结合[20]MCE 相关产品Puromycin dihydrochloride
一种氨基核苷类抗生素，抑制蛋白合成。G-418 disulfate
一种氨基糖苷类抗生素，抑制真核生物和原核生物的蛋白质合成。Bekanamycin
一种氨基糖苷类抗生素，抑制一系列革兰氏阳性和阴性细菌。Tetracycline
一种广谱抗生素，对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌有抑制活性。Bleomycin hydrochloride
一种 DNA 损伤剂，抑制 DNA 合成；一种抗肿瘤抗生素。Neomycin sulfate
一种氨基糖苷类抗生素，通过核 30S 核糖体亚单位的不可逆结合发挥抗菌活性，从而阻断细菌蛋白质的合成；一种已知的磷脂酶 C (PLC) 抑制剂。Gentamicin sulfate
一种氨基糖苷类抗生素，抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性细菌的生长并可抑制组织培养中的多种支原体菌株。MCE 的所有产品仅用作科学研究或药证申报，我们不为任何个人用途提 *** 品和服务
