本
文
摘
要
背景
过去的五年中，非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗进展主要集中在免疫单药或免疫联合治疗领域。PACIFIC临床试验成功改善了患者的OS和PFS，度伐利尤单抗已成为局晚期NSCLC同步放化疗（CCRT）后的标准疗法。免疫检查点抑制剂（ICIs）主要作用是解除免疫系统的抑制，因此将ICIs与其他可以诱导强大抗肿瘤免疫反应的治疗方式结合起来是合理的。放疗（RT）可以诱导肿瘤特异性免疫反应，尤其是免疫原性细胞死亡（ICD），表达和/或释放多种危险相关分子模式DAMPs(如ATP、细胞核酸、HMGB1、ANXA1)、细胞因子（如INF-1、CCL2、CXCL1和CXCL10）及ER分子伴侣（如钙网蛋白、ERp57、Hsp70和Hsp90）。这些ICD相关的分子被天然免疫细胞识别并促进这些细胞的激活和成熟，之后天然免疫细胞可以激活适应性免疫反应。
目前临床上还没有方法来识别放疗联合免疫治疗获益的患者，或对免疫治疗表现出原发性或继发性耐药的患者。因此，对NSCLC患者RT诱导的免疫原性反应的程度进行分析是至关重要的。最新证据表明，立体定向放疗(SBRT)是一种向癌细胞提供超高剂量的放疗方式，与常规放疗相比，局部肿瘤控制更好，免疫调节潜力更高。尽管目前对RT的免疫调节特性进行了深入的研究，但RT诱导NSCLC患者发生哪些免疫变化还是未知的。本项前瞻性探索性研究利用Olink技术识别与NSCLC患者RT治疗无进展生存期(PFS)相关的潜在预后和预测性外周循环免疫蛋白。最终发现Ⅰ期NSCLC患者中CD244(HR：10.2, 95%CI：1.8-57.4)是负向预后生物标志物，Ⅲ期NSCLC患者中CR2和IFNGR2是正向预后生物标志物(CR2，HR：0.00, 95%CI：0.00–0.12；IFNGR2，HR：0.04, 95%CI：0.00–0.46)。本项研究结果发表在Cancers(Basel)（IF：6.639），标题为“Identifification of Potential Prognostic and Predictive Immunological Biomarkers in Patients with Stage I and Stage Ⅲ Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC): A Prospective Exploratory Study ”
研究方法
前瞻性地纳入2017年5月至2019年3月期间诊断为I期（26例）或Ⅲ期（18例）NSCLC患者，I期NSCLC患者（组1）采用SBRT(54 Gy in 3 fractions, 48 Gy in 4 fractions, or 60 Gy in 8 fractions)进行治疗。Ⅲ期NSCLC患者（组2）同时接受含铂双药化疗（顺铂或卡铂联合依托泊苷）及放疗（60–66 Gy in 2 Gy fractions, 一周五次）。第一次放疗前（V1）、组1第二次及组2第三次放疗前（V2）、以及最后一次放疗结束后（V3）收集血液样本。利用Proximity Extension Assay (Olink Proteomics)、Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 、Serum-Functional Immunodynamic Status (sFIS) Assay进行蛋白检测分析，最后通过统计学分析方法研究蛋白和预后的相关性。
图1. 研究流程图研究结果
1.经SBRT治疗的I期NSCLC患者血液循环中免疫原性细胞死亡相关蛋白的检测
第一次放疗后，与CXCL10低水平的患者相比，CXCL10表达水平增加与较短的PFS显著相关(HR = 3.86, 95% CI: 1.01–14.7; logrank ∆v2−v1 p = 0.0063)（图2a）。与单独CXCL10相似，同样也观察到CXCL9/CXCL10/CXCL11趋化因子(主要由IFN-γ诱导)的循环表达水平升高与较低的PFS相关(∆v2−v1 logrank p = 0.07)（图2b）。
图2a. CXCL10循环表达水平与PFS相关性
图2b. CXCL9/CXCL10/CXCL11循环表达水平与PFS相关性2.经CCRT治疗的Ⅲ期NSCLC患者血液循环中免疫原性细胞死亡相关蛋白的检测
Ⅲ期NSCLC患者在CCRT治疗结束时，CALR表达水平升高与更好的PFS显著相关。(HR = 0.12, 95% CI: 0.02–0.85; logrank ∆v3−v1 p = 0.048) （图3）。
图3. CALR表达水平与PFS相关性3.NSCLC患者潜在预后免疫相关蛋白的鉴定
应用Olink蛋白组学研究方法更广泛的筛选血浆蛋白质标志物并分析其与PFS的关联，在I期、Ⅲ期NSCLC患者中鉴定到与PFS相关的top 10蛋白（图4a, d)。由于最初关注的是SBRT和CCRT潜在免疫诱导特性，所以只选择了免疫相关蛋白进行进一步的分析（图中红色标注）。I期NSCLC患者中，鉴定到CD244是一种潜在的预后蛋白(HR：10.23, 95%CI：1.82–57.42)（图4a）。用基线CD244中位归一化的蛋白表达（NPX）值作为阈值，将I期NSCLC患者分为low和high NPX-based “risk groups”，结果揭示两个“risk groups”之间存在显著差异。与基线时low CD244 NPX-based “risk group”相比，基线时(v1 “low CD244” vs. v1 “high CD244”, p < 0.001)、第二次 SBRT(v1 “low CD244” vs. v2 “high CD244”, p = 0.029)、最后一次SBRT(v1 “low CD244” vs. v3 “high CD244”, p = 0.0056) 时high NPX-based “risk group”的CD244 NPX值显著更高（图4b）。生存曲线分析表明， high CD244 NPX-based “risk group”与更差的PFS相关(logrank p = 0.17) （图4c）。 在Ⅲ 期 NSCLC 患者中，鉴定到2型补体受体 (CR2) 和干扰素 γ 受体 2 (IFNGR2) 是潜在的预后蛋白(CR2–HR: 0.00, 95% CI: 0.00–0.12; IFNGR2–HR: 0.04, 95% CI: 0.00–0.46)（图4b）。用基线CR2或IFNGR2的中位NPX值作为阈值，将Ⅲ期NSCLC患者分为low和high NPX-based “risk groups”，结果显示两组之间存在显著差异。High NPX-based “risk group”组的在基线（V1）及第三次放疗（V2）中CR2 NPX 值显著高于low-based “risk group”的基线CR2值 (v1 “low CR2” vs. v1 “high CR2”, p= 0.007; v1 “low CR2” vs. v2 “high CR2”, p = 0.045, respectively)（图4e)。生存分析显示，基线CR2表达水平升高与更好的PFS显著相关(logrank p = 0.006）（图4f）。high NPX-based “risk group”组在基线（V1）及第三次放疗（V2）中的IFNGR2 NPX 值显著高于low-based “risk group”中基线 IFNGR2 值(v1 “low IFNGR2” vs. v1 “high IFNGR2”, p = 0.0022; v1 “low IFNGR2” vs. v2 “high IFNGR2”, p = 0.01)（图4g)。生存分析显示，基线IFNGR2表达水平升高也与更好的PFS显著相关(logrank, p < 0.001）（图4h）。
图4. NSCLC患者预后免疫相关蛋白鉴定4.NSCLC患者潜在预测性免疫相关蛋白的鉴定
除了识别潜在预后免疫相关蛋白外，本篇文章还研究了治疗诱导血浆蛋白表达水平随时间的变化与结果的相关性。在I期NSCLC患者中，鉴定到与PFS相关的top10蛋白（delta NPX value）如图5a所示。同样，只选择免疫相关蛋白进行进一步分析（图5a红色表示）。用基线IL-10中位NPX值作为阈值，将I期NSCLC患者分为low 和 high NPX-based “risk groups”，观察到IL-10表达差异在基线时已经存在，并不受SBRT的影响（图5b）。High NPX-based “risk group”的IL-10 NPX值在基线（V1）、第二次SBRT（V2）、及最后SBRT（V3）中显著高于low-based “risk group”的基线 IL-10值(v1 “low IL-10” vs. v1 “high IL-10”, p < 0.001; v1 “low IL-10” vs. v2 “high IL-10”, p < 0.001; v1 “low IL-10” vs. v3 “high IL-10”, p = 0.0019)。此外，KM生存曲线分析显示，基线时(logrank v1, p = 0.045)，SBRT治疗中(logrank ∆v2−v1, p = 0.003)，治疗后(logrank ∆v3−v1, p = 0.03) ，高的血浆IL-10水平与差的PFS显著相关（图5c）。
图5. I期NSCLC患者治疗反应中变化的预测免疫相关蛋白的识别结论
该篇文章利用Olink技术在RT治疗前和治疗中的血液中鉴定了几种循环免疫原性蛋白的表达水平与PFS相关，克服了组织样本不可及的难题，利用血液无创检测外周循环蛋白质组实现了机体免疫反应的实时监控。I期NSCLC患者中，CD244是负向预后生物标志物。Ⅲ期NSCLC患者中，CR2 和IFNGR2是正向预后生物标志物。此外，治疗诱导循环免疫原性蛋白表达水平的变化鉴定到CXCL10和IL-10可以作为负向预测生物标志物。该项临床研究是一项前瞻性探索性试验，后续仍需更大的患者队列验证。
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