本
文
摘
要
【Boxbio】游离胆固醇含量检测试剂盒（货号：AKFA002）
胆固醇（Cholesterol）又称胆甾醇，是广泛存在于动物体内的一种环戊烷多氢菲衍生物，可作为合成肾上腺皮质激素、性激素、胆汁酸及维生素D等生理活性物质的重要原料，也是构成细胞膜的主要成分，总胆固醇（TC）是指所有脂蛋白所含胆固醇的总和，包括游离胆固醇和胆固醇酯。
胆固醇酯酶可催化胆固醇酯水解生成游离胆固醇（FC）和游离脂肪酸（FFA），胆固醇氧化酶可催化游离胆固醇氧化生成∆4-胆甾烯酮和H₂O₂，过氧化物酶催化H₂O₂氧化4-氨基安替比林和酚生成红色醌类化合物，产物在500 nm处具有特征吸收峰，通过吸光值变化即可定量检测总胆固醇的含量。
名称试剂规格储存条件使用方法及注意事项提取液液体60 mL×1瓶
（自备试剂）4℃避光保存异丙醇
（C3H8O，MW = 60.06，CAS: 67-63-0）试剂一液体70
mL×1瓶4℃避光保存-试剂二液体700 μL×1支4℃避光保存-试剂三液体700 μL×1支4℃避光保存-标准品粉剂×1支
（10 mg胆固醇标准品）4℃保存使用前加入517 μL提取液充分溶解
（即为50 μmol/mL胆固醇标准液）标准稀释液的制备：将50 μmol/mL胆固醇标准液使用提取液稀释至2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 μmol/mL即为标准稀释液。序号A123456稀释前浓度（μmol/mL）50102.01.00.50.250.125标准液体积（μL）100100200200200200200提取液体积（μL）400400200200200200200稀释后浓度（μmol/mL）102.01.00.50.250.1250.0625注：有机试剂移液过程易产生体积误差，建议润洗枪头后进行移液，并及时更换枪头。
测定过程中所需要的仪器和试剂：可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、可调式移液器、台式离心机、恒温水浴/培养箱、异丙醇和蒸馏水。
1.总胆固醇的提取（可根据预实验结果适当调整样本量及比例）
①细菌或细胞：离心收集细菌或细胞至离心管内，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为（500-1000）：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1 mL提取液）处理样品，冰浴超声破碎（功率300 W，超声2 s，间隔3 s，总时间3 min），4℃ 10000 g离心10 min，取上清置于冰上待测。
②组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：（5-10）的比例（建议称取0.1 g，加入1 mL提取液）处理样品，冰浴匀浆，4℃ 10000 g离心10 min，取上清置于冰上待测。
③血清（浆）、培养液等液体样本：直接测定或适当稀释后再进行检测。
注：分离血清或血浆应为非溶血样本，提取后待测样本不能用于蛋白浓度测定，需另取样本测定。
2.测定步骤
①分光光度计预热30 min以上，调节波长至500 nm，蒸馏水调零。
②TC工作液的制备（现用现配）：按试剂一：试剂二：试剂三= 1 mL：10 μL：10 μL的比例配置。
③在离心管中依次加入下列试剂：
试剂测定管
（μL）标准管
（μL）空白管
（μL）待测样本100--标准稀释液-100-提取液--100TC工作液900900900充分混匀，37℃显色15
min吸光值测定：测定500 nm处吸光值，记为A测定、A标准和A空白；计算∆A测定=A测定-A空白，∆A标准=A标准-A空白。注：空白管只需测定1-2次。
标准曲线的建立：以2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 μmol/mL标准稀释液浓度为横坐标（x），其对应的∆A标准为纵坐标（y），绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将∆A测定带入公式中得到x（μmol/mL）。
注意事项
①若∆A测定超出标准线性吸光值范围：高于最高值建议将待测样本使用提取液适当稀释后再进行测定，低于最低值建议适当增加样本量后再进行测定，计算时相应修改；
②为保证结果准确且避免试剂损失，测定前请仔细阅读说明书（以实际收到说明书内容为准），确认试剂储存和准备是否充分，操作步骤是否清楚，且务必取2-3个预期差异较大的样本进行预测定，过程中问题请您及时与工作人员联系。
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.
