本
文
摘
要
双荧光素酶报告基因系统（Dual-Luciferase® Reporter Assay System）是一种以使用荧光素（Luciferin）作为底物来测定萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）活性的报告系统。自然界存在的荧光素酶主要来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。目前，荧光素酶主要来源于北美萤火虫(Photinus pyralis)。它是一个61 kDa的单体酶，可以编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，无需表达修饰，直接具有完全酶活。荧光素酶能够氧化荧光素发出生物荧光，通过光学测定仪或多功能酶标仪测定荧光素在氧化过程中释放的荧光值，可以灵敏、准确地检测出 miRNA是否作用于靶基因 3’UTR。
在实际的实验操作中，双荧光素酶报告基因用海肾荧光素酶（Ranillaluciferase）作为内参就好像qPCR内参一样，为试验提供了基准线，这是单荧光素酶报告基因实验所不具备的，后者容易受到各种内外部因素的影响。通过将包含萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶基因的质粒转入同一细胞，从而减小转染效率和细胞活性等因素对实验造成的影响，使得实验结果更为科学可信。除了可信度大大提高以外，双荧光素酶报告基因载体更加灵敏，能尽可能地降低影响实验准确性的内在因素。而且相比较Western blot具有操作过程繁琐，检测灵敏度较低等问题，双荧光素酶报告基因的检测比较快速、步骤简便，现已被广泛应用于不同启动子下外源基因表达强度和转录调控研究的报告。
双荧光素酶报告基因系统实验原理为：双萤光素酶报告基因载体上含有两种荧光素酶基因，分别是萤火虫荧光素酶基因和海肾荧光素酶基因，二者没有序列同源性，并且分别对应各自的反应底物，消除了实验过程中的干扰。在检测的过程中，由于miRNA主要作用于靶基因的3’UTR，所以将靶基因mRNA的3’UTR和定点突变靶点的片段插入至双荧光素酶基因载体下游的多克隆位点（MCS）中，并将构建好的重组载体质粒与miRNA或miRNA 模拟物（miRNA mimics）共转染到工具细胞中，检测萤光素酶的活性变化，从而可以定量反映miRNA是否对潜在靶基因起作用。以此来确定转染载体中是否含有miRNA的靶位点。
实验方法
1）裂解细胞:弃去旧的细胞培养液，每孔加100 μL细胞裂解液，110 r/min离心15 min充分裂解细胞（粘在板底的可以用枪头刮下保证细胞完全裂解）。
2) 细胞完成裂解后，每孔细胞转移至灭菌的离心管，4℃离心机10000 r/min 离心5 min，取上清液。
3) 缓慢水浴融解萤火虫荧光素酶检测试剂和海肾荧光素酶检测缓冲液至室温。
4) 开启MODΜLUSTM单管型多功能检测仪，设置检测参数，检测。
5) 检测萤火虫荧光素酶活性值F(Firely Lueiferase)时，每个细胞样品加入100 μL。
6) 萤火虫荧光素酶检测试剂，混匀后将离心管立即放入荧光检测仪，计算F值。
7) 加入100 μL海肾荧光素酶检测工作液，混匀后立即放入荧光检测仪，计算海肾荧光素酶活性值R。
8) 完成所有样品测定后，根据之前检测到的各组的F值和R值，计算得出相对荧光素酶活性。
