酶标仪测DNA和RNA浓度（酶标仪测DNA）

SpectraMax®微孔板读板机具有检测精度高和重复性好等特点，能够准确的检测260nm波长处光吸收值。使用Molecular Devices公司专利的PatchCheck® 传感器后可将获得的结果自动转换为1cm光径下相对应的读值，使得该值与使用标准比色皿检测后获得的结果具有可比性。SoftMax®Pro软件能够自动计算出结果并以报告格式输出。

优势

可检测8,12和96道移液器准确度和精度最低检测体积4ul使用水或者已知分装试剂 只需几分钟

SoftMax Pro软件中设置 PatchCheck功能

可见PatchCheck设置选项在SoftMax Pro 6 软件设置步骤中位置(见图一)，用户如勾选上“PatchCheck” 功能后，软件会自动将光吸收结果换算为标准1cm 光径下的读值。

图一

材料

SpectraMax Plus或SpectraMax 190微孔板读板机（Molecular Devices，LLDUV-可透型微孔板e.g. UV-Plate(CorningCostar Cat.#3635),UV-Star(Greiner Cat.# 655801, E & K Scientific Products), UVMax(Polyfiltronics, Whatman Labsales), 石英微孔板(Hellma cells,Inc.)

UV-可透型微孔板

目前石英微孔板已被广泛应用，但是价格比较贵 (>$1,000)，标准的聚苯乙烯微孔板不适于紫外光区 的检测，因为低于300nm波长的光无法穿透此类材 质的微孔板，除了石英微孔板外，至少还有三种UV可透型塑料材质的微孔板可用于300nm以下波长的 检测(图二)，Corning Costar UV和Greiner UV型微 孔板可支持穿透光的波长下限达到215nm左右， Polyfiltroincs UV型微孔板可支持穿透光的波长下限在 240nm，但其在280nm波长处有一个小的吸收峰。

图二

在SPECTRAmax plus微孔板读板机上检测，不同微孔板光谱扫描(每孔含有200ul水)结果，从左至右石英微孔 板、Greiner UV微孔板, Costar UV微孔板, Polyfiltronics UV微孔板 和普通聚苯乙烯微孔板。

如何获得最优检测结果

使用洁净的微孔板和澄清的溶液

注意如果缓冲液的光吸收值作为空白对照时，如果这些结果不能够落在期望的动态 区间内，最大可能性是微孔板表面不够洁净、残次品或者孔内有颗粒物。当石英微孔板内加入水后其在260nm处的光吸收值 在0.03-0.04之间，标准偏差值(SD)< 0.002。Costar UV和Greiner UV的微孔板可能由于批次不同或许会略有差别，但是在260nm处光吸收的平均 值在0.045-0.06之间，标准偏差均值(SD<0.002)， Polyfiltroincs UV型微孔板检测背景值会更高，但是可以通过预读一下微孔板然后 每孔相应的减去其背景值的方法来获得理想的检测结果(软件自动进行优化)。

如果你的实验过程要用大量稀释液对少量的样品(1-20ul)进行稀释时，首先吸少量样品，然后加入稀释缓冲液中，在SpectraMax微孔板读板机上自动震荡 10-20S。如果你的实验过程要用大量稀释液对少量的样品(1-20ul)进行稀释时，首先吸少量样品，然后加入稀释缓冲液中，在SpectraMax微孔板读板机上自动震荡 10-20S。例如光吸收值较低的样品，可同过增加样品溶液的体积(250-300ul)来获得最长的光路径，如果可能的话可做两至三个平行孔。使用PathCheck传感器可将260光吸收值自动换算为标准1cm光径下的读值。

DNA样品的检测

如图三所示DNA在260nm波长处的光吸收值，检测下限(即光吸收值高于空白SDs值的3倍)大约是25ng/孔，定量下限大约是75ng/ 孔(试剂空白SDs值d的10倍)，使用微孔板检测的结果与已发表文献中使用分光光度计来检测260nm波长处DNA的光吸收的结果相吻合，对更低浓度的DNA定量检测时需要其它更加灵敏的检测技术，例如荧光染料方法。

图三：光密度范围

使用DNA的水溶液制作标准曲线，300ul/ 孔。Costar UV微孔 板，小牛胸腺DNA稀 释于水中，稀释浓度范围从0.1-1.5ug/ml， 三个复孔且每孔300ul 体积，加入到Costar UV微孔板中，使用 PatchCheck功能在 260nm波长处进行检测。

使用DNA(or RNA)吸光率估算浓度值

DNA(或RNA)浓度值通常用标准1cm光径下的吸光率除以260nm 波长处光吸收值来进行估算(或乘以它的倒数)。使用PatchCheck 后，SpectraMax读板机就能自动将光径转换为标准1cm的长度并计算浓度值。双链DNA的1/吸光率值在标准1cm光径长度下大约为50ug/ml。然而，只有当溶液中盐离子浓度较高情况下这个值是正确的(图四)。DNA在水中的吸光率较在盐离子溶液中的吸光率高出30%左右。

图四：盐离子浓度对DNA在260nm波长下吸收值的影响

DNA溶于去离子水或TE缓冲液(10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.4)，或者TES (TE buffer + 0.9% NaCl)，(1/吸光率值)；7个浓度的平均值(2.5ug-50ug/ml), 每个样品4个重复。

SoftMax Pro 软件

DNA(或RNA)检测试验通常需要将少量样品(2-10ul)稀释后，测量其在260nm波长处的光吸收值。SoftMax Pro软件能够自动计算其在260nm波长处的光吸收值，确定样品的原始浓度值和计算出后续试验需要的样品体积。SoftMax Pro软件同样能够兼移液系统，最小设置0.5ul步进。例如图五所示在260nm处检测5ul体积的样品，目标DNA含量需求为0.4ug。每个样品需要的体积计算后以 0.5ul进行四舍五入,这些结果很容易导出到其它数据处理系统中。

图五：提取DNA

SoftMax Pro软件可列出DNA抽提的结果和计算出含有一定量DNA的溶液体积， 可自动生成报告。

总结

现在使用微孔板精确、重复的检测DNA(或RNA)的数值变得更加容易，其定量检测结果的下限可与传统的UV-Vis分光光度计相媲美，PatchCheck传感器会自动将检测结果换算成为标准1cm光径下的读值，SoftMax Pro软件不但会自动算出其浓度，还可以给出后续步骤中需要移液的体积。

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