本
文
摘
要
质粒DNA的提取及鉴定
一质粒DNA的提取及鉴定
1．收获细菌
（1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。
（2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。
（3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
2．碱裂解法小量抽提质粒
（1）将细菌沉淀[上述步骤（3）所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）中，剧烈振荡。
（2）加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS），缓和振荡，水浴5min。
（3）加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml），缓和振荡，冰浴5min。
（4）4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。
（5）可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，（4）。
（6）用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。
（7）4℃以12000g离心5min。
（8）小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。
（9）用75%乙醇于4℃洗涤DNA，同上离心去上 *** 空抽干。
（10）加50μl的1×TE（含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶），振荡，贮存于-20℃。
二质粒DNA的大量制备
（1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。
（2）将1ml含菌液倒入含相应抗生素的Lb 100ml中，37℃振荡培养至A590=1.0(5～6h)。
（3）加氯霉素（170μg/ml）扩增，37℃温箱中培养过夜。
（4）收集菌液于离心管中，冰浴10min。3000rpm,离心10min，去上清。
（5）加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min。
（6）加溶液Ⅱ10ml轻轻混匀，室温下5min。
（7）加溶液Ⅲ7.5ml轻轻混匀，冰浴30min。15000rpm，4℃离心20min。
（8）取上清液于高速离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀，入-20℃3～5h。
（9）15000rpm 4℃ 离心20min。
（10）弃上清，将离心管倒放入真空泵中抽干（10～15min）。
（11）用5ml1×TE溶解，加入RNase A 15～20μl，42℃水浴4h于过夜。
（12）加入5ml饱和酚，混匀，4000～5000rpm离心5min，取上清液入5ml离心管内。
（13）分别加入2.5ml饱和酚，2.5ml氯仿，混匀后同样离心收集上清。
（14）加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀，同样离心收集上清。
（15）加入1/10体积的3mol/l NaAc及2倍体积的无水乙醇于-20℃3～5h。
（16）10000rpm 4℃离心20min。
（17）弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。
（18）离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解质粒DNA。
三质粒DNA的鉴定
1．酶切反应
（1）在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。
（2）取反应物点样，观察酶切效果。
（3）酶切完全后，70℃5min终止反应。
2．琼脂糖电泳
（1）配制所需浓度琼脂糖凝胶。
（2）在待测的DNA样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂，混匀后点样。
（3）打开电源开关，5V/cm电泳。
（4）在UV灯下观察电泳结果。
DNA的重组
一DNA的酶切与连接
（1）酶切反应
同质粒DNA的鉴定，只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切，则成比例增加。
（2）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。
（3）15000rpm离心15min，弃上清。
（4）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。
（5）加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。
（6）测定DNA的含量。
（7）加入线性载体DNA和含量3～4倍于载体的待插入DNA片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反应12～16h。
（8）连接反应液可置-20℃保存，供转化用。
（9）关于待插入DNA片段的获得参见附注。
二大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化
1．感受态的制备
（1）接种单菌落于2ml LB培养液中， 37℃过夜。
（2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。
（3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。
（4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。
（5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。
2．重组DNA的转化
（1）将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记，然后按下述进行：
（2）冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。
（3）42℃90s。
（4）37℃水浴5min。
（5）加入无相应抗生素的Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。
（6）分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。
三转化子DNA的快速鉴定－快速细胞破碎法
（1）挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中，37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8。
（2）取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。
（3）加入70μl Cracking Gel缓冲液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚蓝1.67ml，加双蒸水至200ml]，混匀后，37℃水浴30min以上。
（4）15000rpm离心15min。
（5）吸取上清点样电泳，观察。
四转化子DNA的酶切鉴定
1．转化子DNA的快速少量抽提
（1）挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中，37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8。
（2）菌液移至5ml Eppendorf 管中，9000rpm,离心9min，去上清。
（3）加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混匀，冰浴10min。
（4）15000rpm离心15min。
（5）吸取上清，加入异丙醇1ml混匀，置室温15～30min。
（6）15000rpm离心15min，弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。
（7）离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解DNA。
（8）取少量DNA电泳，观察浓度。
2．转化子DNA的小量酶切鉴定
【同质粒DNA的小量酶切鉴定，见上文（三、质粒DNA的鉴定）】
五重组子DNA的进一步鉴定
（1）用合适的酶切割DNA并电泳。
（2）于紫外灯下从凝胶上切下所要的DNA带，装入含1×TBE缓冲液的透析代内，用夹子封好袋口，并检查有无漏孔。
（3）将透析袋（纵长）与两极间的边线垂直放于电泳槽内电泳，4～5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。
（4）取出透析袋，挤出凝胶块，吸出袋内液体放入1.5ml的离心管内，10000rpm离心5min。
（5）吸出上清放入离心管内，加入等体积的饱和酚和等体积的氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，吸出上清放入新的离心管内。
（6）加入1/10体积的3mol/L AaAc,2倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃放置4～5h。
（7）于4℃，10000rpm离心15min，弃上清。
（8）用75%的酒精洗涤2次，每次均于4℃，10000rpm离心5min，弃上清。
（9）真空抽干，并用适量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。
