本
文
摘
要
染色体免疫共沉淀（Chromatinimmunoprecipitation，ChIP）是一种可在体内用来确定与某一特定蛋白结合或蛋白定位所在的特异性DNA序列的技术。不好理解的话可以拆分成三部分：
“染色质”就是由“组蛋白和DNA”组成的物质；“免疫”就是通过抗体和靶蛋白（抗原）特异性结合，这里指用商品化或自制抗体和染色质中组蛋白结合，形成复合物；“共沉淀”就是2-3种物质形成的复合物通过沉淀的方法来分离。所以ChIP技术就是“利用染色质中组蛋白和外源抗体的特异性结合，将染色质沉淀下来并进行分离“。
ChIP是一项比较流行的研究转录因子（ transcription factor,TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。
实验原理
染色质免疫沉淀技术（ChIP）通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。ChIP技术最大的优点就是在活体细胞状态下研究了蛋白质和目的基因结合状况，减少了体外实验的误差。在活体细胞中，先对与调节蛋白结合的染色质进行分离，然后通过一定的方法（例如：超声波）随机剪切染色质，用调节蛋白的抗体沉淀目的染色质，再通过一定手段把目的染色质上的蛋白质去除掉，最后用PCR等方法检测鉴定共沉淀的DNA片段的特性。
实验流程
一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA片断——PCR分析。
实验步骤
第一天：
（一）细胞的甲醛交联与超声破碎。
1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9 ml）
2. 37摄氏度孵育10min。
3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。
4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5. 细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。预冷后2000 rpm 5 min收集细胞。
6. 倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200 ul含2×10的6次方个细胞。这样每100 ul溶液含1×10的6次方个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×10的6次方个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×10的6次方个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800 ul。
7. 超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。
（二）除杂及抗体哺育。
8. 超声破碎结束后，10，000 g 4度离心10 min。去除不溶物质。留取300 ul做实验，其余保存于－80度。300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl （NaCl终浓度为0.2 M），65度处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
9. 在100ul的超声破碎产物中，加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。再各加入60 ul Protein A Agarose/SalmonSperm DNA。4度颠转混匀1h。
10. 1 h后，在4度静置10min沉淀，700 rpm离心1min。
11. 取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1 ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。
（三）检验超声破碎的效果。
取100 ul超声破碎后产物，加入4 ul 5 M NaCl，65度处理2 h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。
第二天：
（一）免疫复合物的沉淀及清洗。
12. 孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转2 h。
13. 4度静置10min后，700 rpm离心1min。除去上清。
14. 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700 rpm离心1min，除去上清。
洗涤溶液：
a. low salt washbuffer----one wash
b. high salt washbuffer-----one wash
c. LiCl washbuffer------one wash
d. TE buffer------twowash
15. 清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100 ul 10％SDS， 100 ul 1 M NaHCO3， 800 ul ddH2O，共1 ml。每管加入250 ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500 ul。
16. 解交联：每管中加入20ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M）。混匀，65度解交联过夜。
第三天：
（一）DNA样品的回收
17. 解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1 h。
18. 每管加入10ul 0.5M EDTA，20 ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2 ul 10 mg/ml 蛋白酶K。45度处理2 h。
19. DNA片段的回收―――胶回收试剂盒。最终的样品溶于100 ul ddH2O。
（二）PCR分析
在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。随着二代测序技术的不断发展，对未知的DNA序列可进行chip-seq分析。
CHIP实验的优缺点
CHIP与常用的DNA与蛋白相互作用的实验方法的比较
CHIP实验相关问题总结
ChIP实验研究转录因子，调控因子结合的DNA和组蛋白结合的DNA操作上最大的区别是什么？
ChIP实验中由于组蛋白在染色质中表达相对较高，也较稳定，所以组蛋白研究起来更为容易，一般需要10的5次方到10的6次方个细胞即可完成一个ChIP反应。转录调控因子表达水平很低，往往是瞬时表达，起始样本量（细胞，组织）要是组蛋白的10倍，一般每个反应至少需要10的7次方个细胞。另外有些转录因子比较大，往往结合多个核小体，因此在染色质断裂的时候，建议使用超声断裂染色质的方法。因为酶法是化学处理，消化的位点往往比较均一，多是在核小体的连接处，酶消化有可能将核小体断裂的同时打断转录因子与DNA的结合。
关于实验分组设置
进行一次标准的染色质免疫沉淀，每一个实验组（如同一药物处理的不同时间点的样品）需要分别设置目的蛋白管、input样品管、阴性对照管和阳性对照管（最好设置一个）。
目的蛋白管：进行一次标准的染色质免疫沉淀，需要 5～10ug 酶切后的交联染色质（此样品量指染色质中 DNA 的含量，按照上述 2.e 部分的描述进行 DNA 浓度测定后确定），用 ChIP缓冲液稀释后（通常稀释 4 倍，稀释后的 ChIP体系不得小于500ul）进行。首先，从 ChIP缓冲液稀释后的目的蛋白管中取 2% 体积的染色质作为input 管样本，不进行免疫沉淀反应，暂时保存在-20 度（等待后续其他样品免疫沉淀步骤完成后，一起进行解交联和 DNA 纯化）。然后，在剩余的目的样品管染色质中加入对应的 ChIP级抗体，加入的抗体量一般在 1~5μg，不宜加入过多的 ChIP抗体。
Input管：每个实验组分出的Input 样品作为组内参照 DNA，要与经过不同 ChIP抗体免疫沉淀后捕获的对应 DNA 样本一起完成解交联和 DNA 纯化后，通过测定（如定量 PCR）进行比较，计算 ChIP沉淀的效率。
阴性对照管：一般可以取 ChIP缓冲液稀释后的目的蛋白管相同含量的染色质作为阴性对照管样本，然后加入正常同型 IgG 抗体（例如，目的蛋白管所用的 ChIP抗体如果为兔抗，此时就需要用正常兔 IgG，加入正常兔 IgG 抗体量与目的蛋白的 ChIP级抗体量相同）。
阳性对照管：一般可以取 ChIP缓冲液稀释后的目的蛋白管相同含量的染色质作为阳性对照管样本，然后加入与目的蛋白的 ChIP抗体量相同的 H3 组蛋白抗体或者 RNApolymerase II 抗体，进行后续沉淀反应。阳性对照管选择的抗体，常常在整个染色质结合位点丰富，用于检测实验操作是否正确，对于初次进行 ChIP实验的操作者推荐使用。
关于细胞
细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。一般细胞长到75％－80％比较好。
关于染色质片段化
片段化的目的是确保高分子量染色质的蛋白质/DNA复合物是可溶的，能被ChIP抗体接近；为确保ChIP实验有良好精度，一般片段化的大小在200-1000bp，一般300-600bp均能获得较好的ChIP结果。如果小于200bp的话，蛋白的结合位点很有可能被打断，原因是由于每个核小体结合DNA的序列长度为175bp，加上不同核小体间的linkerDNA序列，这样每个核小体结合DNA的最小序列大概在200bp左右，如果片段长度大于1000bp，您将会分离获得包含目标序列的DNA，但所要研究的蛋白可能会离您目标序列有700个核苷酸的距离；如果过度片段化可能破坏抗原表位降低PCR效率，片段化不全导致样本丢失，可能会获得假阴性结果。
关于抗体
2011 年的一篇Nature文献报道中显示即使ChIP级别的抗体，结合特异性也只有70%左右，我如何选择高特异性的ChIP级别抗体？
ChIP实验中抗体的选择是实验成功的核心要素。在2011年Nat Struct Mol Biol报道中通过斑点杂交和ChIP-chip试验显示，分别只有73%和78%的抗体具有较好特异性。
作者进一步通过WB检测3个品牌表观抗体的特异性，仅有一个品牌抗体通过特异性检测，另外两品牌抗体未通过特异性结合实验。
由于ChIP级别（ChIP验证过的）抗体数量非常有限，所以当没有ChIP级别抗体时，我们有如下3种方法可以考虑：
1 选择IP/IHC/ICC进行尝试，一般在这些实验中抗体对蛋白的识别结构是native，和ChIP抗体识别结构较为相似；不建议尝试Western blot抗体，因为WB抗体识别的蛋白结构多是denature，并不适合ChIP实验；
2 将蛋白的序列放在NCBI上进行Blast，如果蛋白序列同源性与其他种属或物种蛋白超过80%，可以尝试跨物种抗体；
3 可以使用标签抗体，但是标签页可能干扰转录因子并可能引入假阳性相互作用，因此需要设置好对照，包括未转染细胞的mock IP对照；以及将标签从N端转换到C端作为对照。
如下是具有相关实验经验的大神的实践总结：抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即使是IP级别的。单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。
针对这种情况给大家推荐一个非常好的方法，通过全球最大抗体查询网站CiteAb（http://www.citeab.com/）进行查询，能够获得每个ChIP抗体的文献引用次数（CiteAb显示Merck旗下多种表观遗传抗体全球使用率排名第一）
关于交联与超声破碎
这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。ChIP实验中超声的优化一般从如下几个方面考虑
1 不建议重复已发表的剪切方案而不进行优化。当仪器不同于文献中所使用的仪器时，尤其如此。
2 目前有各种超声破碎仪器，水浴和基于探头的。在使用基于探头的超声破碎仪时，选择一个适用于您的样品体积的探头。
3 在任何情况下，剪切参数都应当根据您的样品体积、细胞密度和细胞类型而优化。
4 优化应当包括功率设置（超声时间 vs. 间隙时间/休息时间）以及获得长度为200 –1000 bp的DNA片段所需的剪切循环数，每个优化实验只优化一种参数；
5 注意时间和功率设置。过度破碎和太高功率设置会损害在免疫沉淀步骤中的表位。降低ChIP信号。
6 始终保持裂解液冰冷，间断超声，而不是连续，因为超声处理产生热量会使染色质变性。
7 在超声破碎过程中避免气泡。泡沫会导致蛋白质的表面变性，可能使染色质损失在气泡中。为了避免这种情况，一开始设为较低功率，再逐步提高。
8 在优化条件时，每个超声破碎循环后通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段的长度。剪切不足所产生大的不溶蛋白质:DNA:RNA复合物可能堵塞琼脂糖凝胶的孔，并延缓电泳过程。通过消化蛋白质、逆转交联、酚:氯仿提取和沉淀来纯化DNA。
如下是具有相关实验经验的大神的实践总结：
一般来讲，按照经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH－3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200 bp－1000 bp。但是200 bp－2000 bp的范围也是可以接受的。
关于磁珠和琼脂糖珠的选择
在早期文献报道以琼脂糖珠为多，琼脂糖珠的优点是价格便宜，但是样本需离心，时间长，另外珠子在离心过程中可能破裂。琼脂糖珠存在非特异性结合，因此需要“预先清洗”染色质，除去可能与蛋白G琼脂糖非特异性结合的蛋白质或DNA。另外分层不明显，样品容易丢失。
当前主流的方法是以磁珠方法较多，磁珠的好处是样本无须离心, 操作时间短，另外磁珠表面光滑，背景低，因此无需封闭。磁珠还有一个好处是带颜色，分层清晰，样品不会丢失，但是磁珠需要需磁力架。因此在免疫沉淀是建议选择磁珠的方法。
琼脂糖珠和磁珠操作示意图，左图为琼脂糖珠，右图为磁珠
关于Protein A和Protein G的beads的选择
蛋白 A微珠与兔多克隆抗体表现出最高的亲和力，而蛋白 G微珠与更广范围的抗体结合，包括大多数但并非全部种类的小鼠单克隆IgG。
当前还有一种ProteinA/G 混合型磁珠，能够为免疫沉淀提供最大的灵活性，综合了蛋白 A和蛋白 G的结合特性，不用考虑不同种属IgG亲和力差异。此外，蛋白 A/G混合物通常比单独使用蛋白 A或G富集的倍数更高，产生的背景更低。因此在免疫沉淀时建议使用A/G混合型磁珠。
下图显示用A+G混合型磁珠能够显著提高免疫沉淀富集倍数
关于样本、抗体和磁珠加样和反应顺序对实验结果的影响
一般有3种反应顺序：
染色质样本+抗体先反应，然后加磁珠；
抗体+磁珠先反应，然后加染色质抗体；
染色质样本+抗体+磁珠三者同时反应。
无论选择哪种微珠，使用磁珠或琼脂糖珠的顺序可能影响您的ChIP信号。
第一种方法先将微珠与捕获抗体共同孵育（室温下几小时，或4°C过夜），接着加入染色质（样本），继续孵育（4°C震荡孵育1小时至过夜）。增加孵育时间有可能增加背景和ChIP信号；然而，与靶点亲和力低的抗体即使延长（过夜）孵育，也不产生明显的ChIP信号。
第二种方法将抗体与染色质样本先共同孵育，再加入微珠也能获得和第一种反应顺序相似的结果，均能较好的进行免疫沉淀反应。但是不建议同时加入这三个组分进行免疫沉淀反应，有实验验证显示同时加入三个组分虽然能减少开展整个反应所需的时间，但是和上述两种方法相比，结果较差。
关于操作
希望尽可能的保持低温（4度）。沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500 rpm等）离心使其完全沉降。虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。
关于解交联
虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜
。关于阳性结果的判断
ChIP实验本身其实就是一个通过免疫沉淀反应验证蛋白与DNA结合能力的实验。因此结果一般包括两个数据：免疫沉淀的效率（富集效率）, 蛋白与DNA 结合能力（富集倍数）。但是这两个结果本身都是一个相对值，因为富集效率就是断裂后的染色质分成两部分，一部分进行免疫沉淀，一部分作为对照不进行免疫沉淀，然后两者进行比较，得到一个百分比。富集倍数就是取两个抗体进行免疫沉淀，一个是特异性的抗体，另一个是阴性抗体（和特异性抗体同种属的lgG）验证抗体是否有非特异性的结合，然后将这两个抗体获得的DNA进行比较，得到一个比值。因此无论是富集效率还是富集倍数其实都只是一个相对的结果，没有特定的数值，富集倍数的高低往往取决于蛋白质靶点的丰度，相对于低丰度的靶点，高丰度靶点有可能产生高的富集。一些实验室将相对于IgG对照的5倍富集设为成功实验的最低阈值。不过，最好将结果与已发表的结果比较，而不是固守设定值。
关于DNA片段的回收
需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。
关于回收DNA PCR和测序的选择
当检测已知蛋白结合的DNA序列的时候，可以使用PCR反应进行检测，PCR可以使用Endpoint PCR和Q-PCR方法，在PCR的时候除了样本组外，还需要设置input对照，阴性对照和空白对照。PCR扩增片段长度200-400bp最佳，模板DNA片段过长，结合位点的邻近DNA会出现一定程度的信号富集。
但是有些情况下，蛋白结合的DNA序列是未知的，这时我们需要使用ChIP结合测序（Seq）方法检测，ChIP-Seq一般包括3个步骤：ChIP反应，文库构建和测序。一般有两种方法操作，一种使用普通ChIP试剂盒，获得纯化的DNA，然后交个测序公司，由公司进行文库构建和测序。还有一种叫做ChIP-Seq试剂盒，这种试剂盒一般包括ChIP反应和文库构建，仅需将构建好的文库交给公司进行测序即可。
