本
文
摘
要
步骤：组织RNA提取（Trizol法）——RNA浓度测定及反转录——跑PCR——数据处理△△CT
1组织RNA提取（Trizol法）
每50mg组织，1ml Trizol，匀浆，最大转速瞬离匀浆管。将溶液吸入到新的EP管中，室温放置5min。加入0.2ml（1/5Trizol）氯仿，剧烈混匀，溶液呈现乳状，室温静置5min，4℃ 12000g离心15min。 吸取上层水相于新的EP管中（注意不要吸到中间层，一般1ml Trizol可以吸到400-500ul液体）。加入1.5倍体积的异丙醇（600ul），上下颠倒混匀，室温静置10min，4℃ 12000g离心10min。弃上清，注意不要弃去RNA白色沉淀，加入1ml 75%乙醇（用DEPC水配）洗涤三次，室温晾干5-10min。加入30ul DEPC水溶解RNA。
Trizol为苯酚+Rnase抑制剂，酸性。
2RNA浓度测定及反转录
NanoDrop测浓度，放置于-80℃冰箱保存或直接进行反转录。
反转录体系：1000ng RNA，4ul 5× RT Master mix，RNase free water补足到20ul
混匀后放入PCR仪反应，条件如下：37℃, 30min → 85℃, 1min → 4℃, ∞
ddH2O将反转录后的cDNA稀释到2.5 ng/ul，-80℃保存。
3Qpcr（48孔板）
内参：Gapdh，引物设计通过NCBI数据库（Gene-家鼠…）
体系：5ulSYBR，0.4ul前后引物，2ulcDNA ，RNase free water补足到10ul
封膜离心跑PCR
数据处理：△△CT法，比较看情况使用t检验或方差分析。Rnase抑制剂，酸性。
2RNA浓度测定及反转录
NanoDrop测浓度，放置于-80℃冰箱保存或直接进行反转录。
反转录体系：1000ng RNA，4ul 5× RT Master mix，RNase free water补足到20ul
混匀后放入PCR仪反应，条件如下：37℃, 30min → 85℃, 1min → 4℃, ∞
ddH2O将反转录后的cDNA稀释到2.5 ng/ul，-80℃保存。
3Qpcr（48孔板）
内参：Gapdh，引物设计通过NCBI数据库（Gene-家鼠…）
体系：5ulSYBR，0.4ul前后引物，2ulcDNA ，RNase free water补足到10ul
封膜离心跑PCR
数据处理：△△CT法，比较看情况使用t检验或方差分析。
