保姆级PCR教程，看完秒上手！

不会还有人不会做PCR吧？作为分子实验界最简单也是最玄学的实验，PCR困扰了一大群人，每次都不禁赞叹无比玄妙的分子之神。

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一、前期准备

PCR实验主要分为两个部分：PCR过程和电泳过程。

1、PCR过程

模板：DNA、cDNA、或经裂解液裂解的直扩样本。

引物：设计合成的目的基因特异性引物，分为上游引物（Primer F）和下游引物（Primer R），一般溶解稀释至工作浓度10 μM。

PCR酶试剂：一般PCR酶试剂盒中包含了DNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPmix等组分。有些试剂盒将这些组分按一定比例混合成Mix形式，可以减少实验误差和试剂损耗。还有一些在Mix酶中加入核酸染料和Loading Buffer，PCR反应完后可直接进行凝胶电泳检测，更为方便。

RNase free water：有些PCR试剂盒中包含RNase free water，有些需要自己准备。

实验器材：不同量程的移液枪、对应的枪头、0.2 ml PCR管（或者8连排PCR管、96孔板PCR管）、低温金属块或实验碎冰、小型桌面离心机、PCR仪。

2、电泳过程

实验试剂：琼脂糖、核酸染料、Loading Buffer、Marker、电泳缓冲液（1x TAE/TBE）。

实验器材：电泳仪、凝胶成像仪、制胶槽、制胶玻璃板、胶孔梳、锥形瓶、微波炉。

二、配制反应体系

为了避免交叉污染，最好进行分区操作，分为反应液区和模板区。在反应液区配制除了模板以外的所有组分，在模板区加入模板。每次实验最好设置不添加模板的阴性对照，以检查是否存在污染。

1、配制预混液

在反应液区操作，先在PCR管上做好标记，置于冰上或者低温金属块上，按照所使用的PCR酶说明书上的体系配制反应预混液。

以艾科瑞生物的AG12204为例，此制品为具有高特异性及优良扩增性的高保真DNA聚合酶，对简单或复杂模板、短片段或长片段 PCR 扩增都具有良好的适应性，还添加了在常温状态下能够抑制 DNA polymerase 活性的单克隆抗体，可以在常温条件下配制预混液。

配制反应液时，可按照先加RNase free water、10×PCR Buffer、dNTP Mix、引物，最后加DAN聚合酶的顺序进行加样，注意模板需在模板区加入。

反应体系

注 *1：ApexHF HS DNA Polymerase CL使用前先离心，将所有 的酶液收集至离心管底部，然后再进行使用，减少损失；使用时应轻轻混匀，避免起泡，酶保存液中甘油浓度较高，应缓慢吸取。 *2：通常模板添加量少于500 ng，可获得良好的扩增效果。若 以cDNA为模板时，建议少于250 ng（模板量相当于Total RNA 的量）。 *3：引物通常使用终浓度为 0.2 μM，可根据实验结果在 0.1– 0.3 μM 范围内调整。

预混液配制注意事项：

（1）当同时进行多个样本的反应时，应先将各种组分（包括RNase free water、Buffer、dNTP Mix、DNA聚合酶等）配置成混合液再分装到每个反应管中，这样可减少试剂损耗，也可以减少实验操作步骤及实验之间产生的误差。

（2）酶制品在使用前先离心，以将酶液收集至离心管底部，避免酶量损失；由于酶保存液中含有较高浓度的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取，使用精确、量程适合的移液枪，并且不要使枪头插入液面过深，否则会因枪头外壁粘着造成损失而使酶量不足。

（3）各组分使用前需彻底溶解并充分混匀，轻轻离心后使用。但不建议将含有酶成分的试剂涡旋，因为涡旋震荡太剧烈会影响试剂中酶的活性。

（4）配制的混合液在分装前需上下颠倒轻柔充分混匀，防止因混合不均匀造成的实验误差，混匀过程中尽量避免产生气泡。

2、添加模板

在模板区，加入适量的模板，加入后盖紧反应管。

模板过多会对PCR扩增产生阻碍，模板过少、模板不纯、降解或有抑制物，会影响PCR扩增效率。

通常用OD260/280来检测DNA纯度。

OD260/280 在1.9-2.1之间，代表DNA纯度较高；OD260/280小于1.9，说明有蛋白质残留；OD260/280大于2.1，可能DNA有部分降解，可经琼脂糖电泳进一步验证。

同时将OD260/230作为参考值。

OD260/230一般大于2.0，表明DNA纯度较好；OD260/230小于2.0，表明有杂质残留，比如碳水化合物或盐（胍盐）等。

注意，若以cDNA作为模板，则以RNA在反转录体系中的浓度来表示cDNA的浓度。因为cDNA 是个反应混合物，里面 dNTP 的吸收峰跟核酸吸收峰很接近，测浓度没有意义， 260 和 2800 自然也没有意义。

三、上机运行

反应体系配制完成后，下一步是上机进行PCR反应。

PCR的扩增程序根据PCR原理分为三步。

步骤①：DNA 进行高温变性，DNA 双螺旋结构解链； 步骤②：引物与单链 DNA 退火；步骤③：引物在 DNA 聚合酶的存在下延伸，与单链 DNA 形成互补链。

一般将步骤①②③称为一个循环，每次进行 DNA 扩增时以此循环 25-35 次。进行 PCR 扩增时，可根据引物的不同调整退火温度，以及根据扩增片段的长度调整延伸时间，进而获得最优 PCR 扩增反应条件。

反应程序

不同的DNA聚合酶反应程序可能有所不同，一般说明书上都有最适的反应程序。

以AG12204为例，进行 3 Step PCR 扩增。

注 *1：对于普通模板，可省略预变性步骤；对于复杂模板，如高 GC或者长片段，建议将预变性设置为94℃反应30 sec-1 min。 *2：变性条件的设定可根据设备进行调整，一般94℃反应10 sec-15 sec，98℃反应 5 sec-10 sec。 *3：Tm值高于55℃时，退火温度设置为60℃；Tm值低于55℃ 时，退火温度设置为55℃。

结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

四、电泳检测

反应结束后，取适量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

常见凝胶浓度可分为 1%（2 kb 以上）、2%（1 kb-5 kb）、3%（100-1000 bp），产物越长，胶浓度越低。常见胶大小可分为大胶（70-100 ml）、小胶（30-50 ml）

1、制胶

（1）溶解：称取适量琼脂糖置于锥形瓶中， 加入对应体积的 1x TAE/TBE，微波炉加热（建议用保鲜膜封口并扎几个小孔，防止液体蒸发和溢出）。当胶液开始沸腾时，停止加热，取出三角瓶先缓慢摇动混匀，待蒸汽大量散发后，再充分摇动混匀（注意过程中瓶口不能朝向人员），再将三角瓶放入微波炉中继续加热溶解。此操作可重复数次，直至琼脂糖粉完全溶解。

（2）冷却：将制胶玻璃槽放入胶槽中，把梳子插在固定位置（小孔梳每孔上样量 10 μl 以内，大孔梳每孔上样量 50 μl 以内），待琼脂糖凝胶液冷却至 55℃左右（瓶底靠手背不烫手即可），加入适量核酸染料，充分摇匀。将液体缓缓贴壁倒入胶槽中，若有气泡可挑掉，室温静置 20-30 min 至胶完全凝固。

（3）取胶：垂直向上轻轻拔出梳子，取出凝胶，连同玻璃板一起放入电泳槽内。电泳缓冲液用1×TAE/TBE，一般跑5-8次胶后就要重新换电泳缓冲液，并且要没过凝胶 1-2 mm。

2、电泳

（1）点样：在点样板上将 Loading Buffer 和样品按比例混好，点入胶孔中，每点一孔应更换枪头，以免污染样品。点样时需将Marker单独点入一个胶孔，Marker的大小需根据检测目的条带的大小进行选择。注意核酸染料不同，上样量会有所差异，可根据实际情况进行调整。

（2）电泳：将电泳槽通电，设置好电压及时间，样品由负极向正极移动（切勿弄反正负极插孔方向，一般负极为黑色，正极为红色），当Loading Buffer跑到2/3时停止跑胶（大约40 min）。

（3）成像：电泳结束，关闭电源，取出凝胶，进行成像观察（不需要带玻璃板），并对比Marker确定片段大小。