本
文
摘
要
文章目录
/CONCENT
原理简介
基因编辑载体构建方法示例
如何对现有编辑载体进行优化
CRISPR/Cas系统递送策略
基因编辑植株检测
伯小远答疑
原理简介
CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas（CRISPR-associated gene）是一种来源于细菌降解入侵病毒的DNA或其他外源DNA的免疫机制，主要由CRISPR元件与Cas 基因组成。
在细菌中，CRISPR元件是一类独特的DNA重复序列簇，由一些高度保守的重复序列（Repeats）和间隔序列（Spacer）相间排列组成，而Cas基因是位于CRISPR序列附近一些高度保守的基因家族，Cas蛋白具有核酸酶活性，可对DNA序列进行剪切。
该免疫系统在工作时，CRISPR序列转录形成CRISPR RNA（crRNA），与另一种转录形成的反式作用型crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）部分区域配对形成二元复合体，然后该二元复合体引导具有核酸酶活性的Cas蛋白切割与crRNA匹配的DNA序列，再整合进入基因组中，当外源DNA再次入侵时，核酸酶切割活性被激活，以实现对外源DNA的切割。
图1 细菌的CRISPR/Cas系统，用来降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA。图片来源：www.hegasy.de
为方便在真核生物中应用，工程化的CRISPR系统将crRNA与tracrRNA融合在一起形成单一sgRNA（single guide RNA）。sgRNA是一段具有特定结构的单链RNA，其5’端约20个碱基（即Spacer，间隔序列）与靶位点互补配对结合，引导Cas9/sgRNA复合物对靶位点进行切割。
▲使用超高速原子力显微镜（HS-AFM）观察Cas9/sgRNA复合物切断DNA，注意看蓝色箭头指示的位置 (Shibata et al., 2017)。
图2 工程化的CRISPR系统。图片来源：www.hegasy.de
伯小远
基因编辑原理及应用#基因编辑#CRISPR/Cas
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▲点击复习CRISPR/Cas原理
植物基因编辑的过程一般可分为六个步骤（图3）：
1
根据靶序列选择合适的核酸酶；
2
构建基因编辑载体；
3
使用原生质体验证这些载体的活性（可选步骤）；
4
将基因编辑元件递送至植物细胞中；
5
通过组织培养将基因编辑的细胞再生为小植株；
6
对所得的基因编辑植物进行筛选和基因分型。
伯小远将在下文对其中的一些步骤重点阐述。
图3 植物基因组编辑的步骤 (Gao, 2021)。
基因编辑载体构建方法示例
在植物中进行基因编辑通常需要同时构建Cas基因表达盒和sgRNA表达盒。Cas 基因的表达通常由35S或Ubi等RNA聚合酶II启动子驱动，以Nos终止子或其他终止子终止；sgRNA表达盒比较小，一般由长约300bp的U3或U6等RNA聚合酶III启动子驱动，以连续6个以上的T碱基终止即可。目前常用的基因编辑载体骨架所有的元件都已构建好（包括Cas基因表达盒和sgRNA scaffold），只需连入与靶位点配对的那一段sgRNA即可。
▲本方法为中国农业大学陈其军教授友情提供，示例展示了构建两个sgRNA连入载体pHSE401的具体步骤 (Xing et al., 2014)。
大家也可从我司“严选商城-分子生物学试剂-载体试剂盒产品-说明书”中参考载体构建的详细实验步骤，或者直接使用我司载体构建技术服务，这个更省心噢！
如何对现有编辑载体进行优化
对于特定物种的基因编辑载体优化策略：
1
需要针对该物种进行Cas9 基因密码子优化或重要氨基酸的突变，表1展示了一些报道过的Cas9变体；
2
选取该物种常用的RNA聚合酶II启动子驱动优化后的Cas9 基因表达（例如在单子叶植物中常用Ubi启动子，在双子叶植物中常用35S启动子）；
3
选取该物种RNA聚合酶III启动子（例如在单子叶植物中常用水稻U3启动子，在双子叶植物中常用拟南芥U6启动子）驱动sgRNA的转录；
4
核定位信号（Nuclear localization signal，NLS）优化，在细胞核中进行基因组DNA编辑需要强NLS，以提升核Cas核酸酶蛋白的丰度，从而实现高效基因组编辑；
5
sgRNA结构优化，sgRNA的二级结构在一定程度上也会影响编辑效率，更稳定的二级结构有助于提高基因组编辑效率；
6
对于多基因编辑常用保守的内源性tRNA分割各个sgRNA表达框；
7
最后一招：通过分析五十多种常见植物密码子频率发现，各物种密码子的偏好性差别不大，所以对于双子叶植物可试用现有针对烟草的编辑载体，对于单子叶植物可试用现有针对水稻的编辑载体。
表1 Cas9的变体 (Zhang et al., 2019)。
CRISPR/Cas系统递送策略
CRISPR/Cas系统递送进入细胞内的形式主要为DNA、RNA和RNP（核糖 *** 白）。
DNA递送方式主要是将Cas基因序列、sgRNA序列通过DNA的形式转入到细胞中，在细胞内完成转录、翻译，实现基因编辑。DNA递送技术手段包括质粒转染、T-DNA插入等。
RNA递送方式主要是将Cas基因序列、sgRNA序列在体外转录得到RNA，然后将RNA通过技术手段转入受体细胞，在受体细胞内完成后续翻译过程，实现基因编辑。
RNP递送方式是将Cas蛋白与sgRNA在体外进行组装，然后将组装好的RNA蛋白复合物一起导入受体细胞中，实现基因编辑。
图4 CRISPR/Cas系统递送进植物细胞的策略 (Zhu et al., 2020)。（a）可通过农杆菌、纳米颗粒、基因枪等方法进行介导，将CRISPR/Cas系统以DNA、RNA或RNP的形式递送进植物细胞；也可通过PEG介导它们进入植物原生质体中；还可利用植物病毒介导它们进入植物细胞并通过胞间连丝转移；（b）从头诱导分生组织的基因编辑体系，首先去除过表达Cas9植株的分生组织，将含有形态发生调节因子（MRs）和sgRNAs的农杆菌培养液注入剪枝位点，可诱导形成新的、基因被编辑过的分生组织；（c）利用植物RNA病毒诱导基因组编辑，将sgRNA与一个RNA移动元件转入TRV病毒RNA2中，通过农杆菌侵染过表达Cas9的植株，即可引入可遗传的突变；（d）通过单倍体诱导子递送CRISPR/Cas系统。
在植物中，最常用的CRISPR/Cas递送策略是DNA递送方式，由农杆菌介导的遗传转化将编辑系统的各个元件通过T-DNA插入至植物基因组中，具体的转化方法大家可参考我司各物种的遗传转化步骤哟！
▲水稻-烟草-大豆-玉米-拟南芥遗传转化过程
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▲番茄-马铃薯-杨树-油菜-棉花-苜蓿遗传转化过程
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基因编辑植株检测
1、基因编辑靶位点检测（一代测序法）：对靶位点进行PCR扩增，一般选靶点上下游250bp以外的位置设计检测引物，避免在复杂结构处设计引物并保证检测引物的特异性。将PCR产物进行一代测序，并把测序结果上传至DSDecode网站进行解析 (Liu et al., 2015)，网站会根据测序的信号双峰嵌套位置和强弱判断突变类型，但当位点存在两种以上的突变类型时，该网站无法进行区分。另一种方法是，将PCR产物进行克隆测序，可以确切判断具体的突变类型，但成本较高。
2、高通量基因编辑靶位点检测：利用二代测序技术对基因编辑材料进行靶位点的鉴定。更详细的原理介绍可参考文章“高通量基因编辑位点鉴定”及我司官网，这种测序方法可以大大降低样本的测序成本，同时也可以很好的区分出各种突变类型。
3、PCR/限制性内切酶（RE）检测：通过对PCR扩增的DNA片段进行限制性酶切分析来区分目标位点是否被编辑。首先设计300-1700bp的扩增子，扩增子包含所要突变的目标片段，之后用限制性内切酶消化该扩增子，最终通过琼脂糖凝胶电泳检测，基于电泳条带的带型进行区分（见下图）。该方法尤其适合对多倍体植物的检测，且也有很多在此方法的基础上发展的其他方法，篇幅所限，伯小远就不一一介绍了。
图5 PCR/RE方法电泳带型可区分出基因编辑类型。条带完全被切开，表示该植株没有产生突变；条带部分被切开，表示该植株为杂合突变或嵌合体；条带完全没有被切开，表示该植株为纯合突变或双等位基因突变。PCR/RE方法的优点：可以检测所有类型的突变，包括SNP和各种大小的插入缺失；具有很高的灵敏性；整个过程需要的时间也比较短，只需要几个小时；检测成本较低；切割产物可以简单地通过琼脂糖凝胶来分辨，非常方便。该方法的局限性是被编辑的位点处必须有限制性酶切位点。
还有其他的一些基因编辑植株检测方法，例如使用定量PCR方法检测靶位点在转录水平上的变化、使用Western blot方法检测靶蛋白的蛋白表达量变化，以及其他方法例如PCR单链构象多态分析法（SSCP）、高分辨率溶解曲线分析方法（HRMA）、单等位基因识别PCR（SAP）、微滴数字PCR（ddPCR）等等，大家感兴趣可以自已查一查噢！
伯小远答疑
1. 转基因植株基因编辑的结果有几种？
植物细胞中有两种途径可以修复DNA双链断裂（DSBs）：同源重组（Homologous recombination，HR）和非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）。HR在植物中的修复效率非常低，NHEJ在DNA双链断裂处容易产生少数碱基的插入或缺失，导致基因失活，这也是目前CRISPR/Cas基因编辑系统的主要修复途径。
对于二倍体植物来说，NHEJ修复之后会产生5种可能的结果：
（1）没有产生任何突变；
（2）单等位基因突变，只有一个等位基因发生突变，也称杂合突变；
（3）双等位基因杂合突变，两个等位基因都发生突变，但是突变的类型不一样；
（4）双等位基因纯合突变，两个等位基因发生相同的突变，这是研究者们最想要的突变类型；
（5）嵌合体，同一个植株上有3种或3种以上的突变类型。
2. Cas9 基因会在转基因植株的后代中分离掉吗？
会的。在构建转基因双元载体时，Cas 基因序列、sgRNA序列位于载体的T-DNA区，转化后T-DNA会插入植物基因组中，但其与靶位点一般来说并不连锁，一旦产生了转基因基因组编辑的突变体后，就可以通过自交或杂交从突变体基因组中分离掉T-DNA，从而获得无转基因成分的突变植物，如图6所示。
图6 获得无转基因成分的突变体的过程 (Gao, 2021)。
3. CRISPR/Cas系统可以用于多基因编辑吗？如何设计载体？
多基因编辑技术对于基因家族及代谢通路的研究具有十分重要的意义。利用CRISPR/Cas系统在植物中进行多基因编辑需要表达Cas基因和多个sgRNA，已发展出许多种多基因编辑系统（见图7），我司最常采用图中第四种方法即多顺反子T-RNA-gRNA的方法来构建多基因编辑载体。
图7 多基因编辑系统汇总 (Zhang et al., 2019)。多个gRNA可通过CRISPR阵列、多顺反子T-RNA-gRNA、HH-gRNA-HDV、Cys4和Drosha蛋白介导的gRNA-shRNA系统来表达。
4. 如何利用CRISPR/Cas系统进行大片段删除？
增加靶点个数可以达到这个目的，片段的两端各设计不少于两个靶点。
5. 基因编辑技术在植物中有哪些应用？
图8 CRISPR技术在植物中的应用 (Zhang et al., 2019)。在细胞质中，CRISPR可以分别通过靶向RNA的Cas蛋白，例如FnCas9、Cas13以及由ADAR衍生的RNA编辑器来切割和编辑RNA分子，也可以被引入细胞器来编辑线粒体、叶绿体的基因组，常用的Cas系统例如Cas9、Cas12a和Cas12b对温度敏感，需要较高的温度才能获得最佳活性。在细胞核中，CRISPR技术用于基因敲除、精准基因组编辑-单碱基编辑、精准基因组编辑-HDR和转录调控。为了敲除基因，CRISPR/Cas核酸酶可以用于靶向编码区或调控元件。单碱基编辑可靶向编码区（例如，引入终止密码子）或调控元件。当具有左同源臂（LHA）和右同源臂（RHA）的DNA修复供体与CRISPR/Cas一起进入细胞，可以通过HDR实现精准的基因组编辑。为了调控转录，CRISPR/Cas核酸酶和碱基编辑器可以用来编辑调控元件或剪接位点，也可以通过dCas蛋白招募调控因子到启动子区域来实现，这些调控因子包括激活因子、抑制因子、DNA甲基转移酶、去甲基化酶等。
伯小远
聊聊基因工程发展史#基因工程#CRISPR#Cas9
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▲一个介绍基因工程的很可爱的视频
