阐述乳酸菌发酵在制药工程行业中的应用（乳酸菌发酵实验及发酵产物定性检测）

近年来，中草药由于其安全、有效、纯天然性在预防和治疗动物疾病方面应用十分广泛，发挥了巨大的作用。大量实验研究表明，中草药饲料添加剂具有促进动物生长发育[1]、提高饲料转化率、改善畜禽产品质量[2,3]、增强动物免疫功能等作用[4] 。随着对中药制剂的深入研究，微生物发酵中药成为一种新的中药研究方法，通过微生物的降解作用，中药的有效成分和活性物质被最大限度的释放出来[5]。另外，微生物发酵中药的过程中，中药的一些成分可能诱导微生物的某些代谢途径发生变化，从而产生新的活性物质[6]。微生物发酵中药将成为中药研究的新内容[7]。

实验中选用公司菌种保藏中心保存的13株性能良好的乳酸菌菌株对具有抗菌、抗病毒作用的5味中药（板蓝根、甘草、陈皮、苦丁、苦藠）进行发酵，并检测了发酵产物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用。旨在为研发出新型抗菌、抗病毒产品提供理论依据。

1材料和方法

1.1 材料 菌株：R3、PP、罗伊氏乳杆菌、乳酸片球菌、6133、RLQ、RDH、7340、ZYRLQ、FLQ、1.1855、LP、SRG由山东宝来 *** 生物研究院菌种保藏中心保存。

中药：板蓝根、陈皮、甘草、苦丁、苦藠购买自永春堂药店。

1.2 方法

1.2.1中药发酵：

将中药磨粉后，各取8g于250ml的三角瓶中，加入80ml纯净水，121℃灭菌30min，每瓶按照4%浓度接入乳酸杆菌菌液，37℃静置培养30h，并设未发酵中药为对照。

1.2.2 平板计数法检测活菌数

发酵30h后，终止发酵，每瓶取1ml发酵液于含9ml的生理盐水的试管中，充分震荡均匀后取1ml于下一个试管中，以此倍比稀释到所要的稀释度（本实验取10-5、10-6、10-7个稀释度），将每个稀释度取1ml滴在灭菌平板上，两个重复，然后加入50℃MRS培养基，摇匀，37℃培养48h，进行菌落计数。

1.2.3 体外抑菌实验（牛津杯法）

吸取15mlLB（1.5%的琼脂）培养基倒入灭菌培养皿中，使其在平皿的底部均匀分布、凝固，作为底层，吸取指示菌液适量加入下层已凝固的平皿中，同时加入5ml，50℃上层LB（0.8%琼脂粉）培养基中，充分摇匀，作为菌层。在每个平板上放置已灭菌的牛津杯（直径为8mm）5个，稍微下压，使其与平板培养基无缝隙。发酵液进行离心，取上清液280ul加入到牛津杯中，静置5-10min，放入37℃培养箱中过夜，次日测量抑菌圈大小并记录。抑菌圈直径大于20mm为极敏，抑菌圈直径15～20mm为高敏，抑菌圈直径为10～15为中敏，抑菌圈直径小于10mm为低敏，无抑菌圈的为不敏感[8]。

1.3 统计分析

实验数据采用SPSS13.0软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1乳酸菌发酵中药对乳酸菌生长的影响

13株乳酸菌发酵5种中药平板计数结果见表1，实验发现乳酸片球菌、乳酸菌R3、6133发酵板蓝根、陈皮、苦丁、苦藠后乳酸菌菌数在108左右，表明乳酸片球菌、乳酸菌R3、6133为发酵4种中药的最适菌株，罗伊氏乳杆菌、乳酸菌PP、RLQ、FLQ、ZYRLQ、7340、1.1855、LP、SRG、RDH发酵板蓝根、甘草、陈皮、苦丁、苦藠后乳酸菌菌数在107-108左右，表明罗伊氏乳杆菌、乳酸菌PP、RLQ、FLQ、ZYRLQ、7340、1.1855、LP、SRG、RDH可以用于发酵5种中药；乳酸片球菌、6133发酵中药甘草后乳酸菌菌数在105左右，表明乳酸片球菌、6133不适合发酵中药甘草。

表1 乳酸菌菌株生长的影响（CPU/ml×108）

菌株/中药

板蓝根

甘草

陈皮

苦丁

苦藠

罗伊氏乳杆菌

0.20

0.27

1.00

0.092

4.20

乳酸片球菌

2.00

0.10

1.00

1.00

10.00

R3

7.00

0.002

6.00

1.00

5.00

PP

0.10

0.50

0.20

0.60

1.00

6133

4.90

0.001

8.90

1.70

1.30

RLQ

0.50

0.23

0.20

0.37

3.10

FLQ

0.10

0.50

0.20

0.60

1.00

ZYRLQ

0.30

0.40

10.00

0.10

1.50

7340

0.30

0.30

2.00

1.00

2.20

1.1855

0.56

0.22

0.30

0.30

3.10

LP

0.91

0.24

0.20

0.70

0.50

SRG

1.10

0.10

0.22

0.23

0.20

RDH

0.60

0.25

0.32

0.37

3.00

2.2 乳酸菌发酵中药上清液对大肠杆菌抑制作用

13株乳酸菌发酵5种中药的发酵液对大肠杆菌抑菌实验结果见表2，实验发现与未发酵中药相比，罗伊氏乳杆菌、乳酸片球菌、R3、6133发酵板蓝根抑菌效果明显，1.1855、RDH发酵产物具有一定的抑菌效果；PP、FLQ发酵甘草后上清液具有明显抑菌效果；罗伊氏乳杆菌、R3、6133发酵陈皮抑菌效果明显，乳酸片球菌、PP 、FLQ、1.1855、RDH发酵产物具有一定的抑菌效果；罗伊氏乳杆菌、6133发酵苦丁的产物具有一定的抑菌效果；罗伊氏乳杆菌、乳酸片球菌、6133、1.1855、RDH发酵苦藠抑菌效果明显，R3发酵后上清液具有一定的抑菌效果。从结果中可以看出罗伊氏乳杆菌、6133发酵板蓝根、陈皮、苦丁、苦藠的上清液对大肠杆菌具有明显的抑菌效果，RLQ、ZYRLQ、7340、LP、SRG发酵五种中药的产物对于大肠杆菌均没有任何的抑菌作用。

表2 发酵中药对大肠杆菌的抑制作用

菌株/中药

板蓝根

甘草

陈皮

苦丁

苦藠

未发酵

低敏

—

低敏

低敏

低敏

罗伊氏乳杆菌

高敏

—

高敏

中敏

高敏

乳酸片球菌

高敏

—

中敏

—

高敏

R3

高敏

—

极敏

—

中敏

PP

低敏

高敏

中敏

—

低敏

6133

高敏

—

极敏

中敏

极敏

RLQ

—

—

低敏

—

—

FLQ

低敏

高敏

中敏

—

低敏

ZYRLQ

低敏

—

低敏

—

低敏

7340

—

—

—

—

—

1.1855

中敏

—

中敏

低敏

高敏

LP

—

—

—

—

—

SRG

—

—

—

—

—

RDH

中敏

—

中敏

低敏

高敏

注：抑菌圈直径大于20mm为极敏，抑菌圈直径15～20mm为高敏，抑菌圈直径为10～15为中敏，抑菌圈直径小于10mm为低敏，无抑菌圈的为不敏感，用“—”表示。

2.2 乳酸菌发酵中药上清液对沙门氏菌抑制作用

13株乳酸菌发酵5种中药的发酵液对沙门氏菌抑菌实验结果见表3，实验发现与未发酵中药相比，罗伊氏乳杆菌、R3、6133发酵板蓝根抑菌效果明显，乳酸片球菌、RDH发酵产物具有一定的抑菌效果；PP、FLQ发酵甘草后上清液具有明显抑菌效果；罗伊氏乳杆菌、乳酸片球菌、R3、6133发酵陈皮抑菌效果明显，1.1855、RDH发酵产物具有一定的抑菌效果；罗伊氏乳杆菌、6133、1.1855、RDH发酵苦丁的产物具有一定的抑菌效果；罗伊氏乳杆菌、乳酸片球菌、6133、1.1855、RDH发酵苦藠抑菌效果明显，R3、PP、FLQ发酵后上清液具有一定的抑菌效果。从结果中可以看出罗伊氏乳杆菌、6133发酵板蓝根、陈皮、苦藠的上清液对沙门氏菌具有明显的抑菌效果，RLQ、ZYRLQ、7340、LP、SRG发酵五种中药的产物对于沙门氏菌均没有任何的抑菌作用。

表3发酵中药对沙门氏菌的抑制作用

菌株/中药

板蓝根

甘草

陈皮

苦丁

苦藠

未发酵

低敏

—

低敏

低敏

低敏

罗伊氏乳杆菌

高敏

—

高敏

中敏

高敏

乳酸片球菌

中敏

—

高敏

低敏

高敏

R3

高敏

—

高敏

—

中敏

PP

低敏

高敏

低敏

—

中敏

6133

极敏

—

极敏

中敏

极敏

RLQ

—

—

低敏

—

—

FLQ

低敏

高敏

低敏

—

中敏

ZYRLQ

低敏

—

低敏

—

低敏

7340

—

—

—

—

—

1.1855

低敏

—

中敏

中敏

高敏

LP

—

—

—

—

—

SRG

—

—

—

—

—

RDH

中敏

—

中敏

中敏

高敏

注：抑菌圈直径大于20mm为极敏，抑菌圈直径15～20mm为高敏，抑菌圈直径为10～15为中敏，抑菌圈直径小于10mm为低敏，无抑菌圈的为不敏感，用“—”表示。

2.3 乳酸菌发酵中药上清液对金黄色葡萄球菌的抑制作用

13株乳酸菌发酵5种中药的发酵液对金黄色葡萄球菌抑菌实验结果见表2，实验发现与未发酵中药相比，罗伊氏乳杆菌、乳酸片球菌、R3、PP、FLQ、LP、 RDH发酵板蓝根抑菌效果明显，ZYRLQ发酵产物具有一定的抑菌效果；乳酸片球菌发酵甘草后上清液具有一定抑菌效果；罗伊氏乳杆菌、乳酸片球菌、R3、LP、SRG发酵陈皮抑菌效果明显；除7340外所有乳酸菌菌株发酵苦丁的产物以及未发酵的苦丁抑菌效果明显；罗伊氏乳杆菌、PP、FLQ、 LP 、SRG发酵苦藠抑菌效果明显，R3、ZYRLQ发酵后上清液具有一定的抑菌效果。从这组结果中可以看出罗伊氏乳杆菌、LP、SRG发酵板蓝根、陈皮、苦丁、苦藠的上清液对金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌效果，7340发酵五种中药的产物对金黄色葡萄球菌没有任何的抑菌作用，同时发现苦丁经7340发酵后丧失了原有的抑菌能力。

表4 发酵中药对金黄色葡萄球菌的抑制作用

菌株/中药

板蓝根

甘草

陈皮

苦丁

苦藠

未发酵

低敏

—

低敏

极敏

中敏

罗伊氏乳杆菌

极敏

—

高敏

高敏

高敏

乳酸片球菌

高敏

中敏

高敏

高敏

低敏

R3

极敏

—

极敏

高敏

中敏

PP

高敏

—

低敏

高敏

极敏

6133

—

—

—

极敏

—

RLQ

—

—

—

极敏

低敏

FLQ

高敏

—

低敏

高敏

极敏

ZYRLQ

中敏

—

低敏

高敏

中敏

7340

—

—

—

—

—

1.1855

—

—

—

极敏

—

LP

高敏

—

高敏

高敏

高敏

SRG

高敏

—

高敏

高敏

高敏

RDH

—

—

—

极敏

—

注：抑菌圈直径大于20mm为极敏，抑菌圈直径15～20mm为高敏，抑菌圈直径为10～15为中敏，抑菌圈直径小于10mm为低敏，无抑菌圈的为不敏感，用“—”表示。

3 讨论

发酵是中药材传统炮制方法之一。早在千余年前，我国就开始选用发酵的方法得到一些药物，如五倍子、红曲、沉香曲等[9，10]。利用益生菌发酵中药已成为近年来研究的新领域，国内已发表多篇以乳酸菌、芽孢菌、酵母菌发酵中药的报道[11，12]。近年研究证实，六味地黄丸发酵后其免疫调节作用显著增强[13]。已有研究证实，芽孢杆菌对50种中药的发酵液具有不同的抑菌活力，表明芽孢杆菌的性质及不同中药的组分对发酵作用具有不同的影响[14]。这些都是利用了微生物强大的生物转化功能。现代发酵过程的进一步研究表明，微生物具有非常丰富的酶系统，具有强大的分解、转化物质的能力，包括氧化、酯化、甲基化、还原化等多种功能，中草药被发酵后，中药的有效成分和活性物质被最大限度的释放出来，同时还可以产生新的活性物质。微生物发酵中药之后，不仅可以改变一些中药的药性、提高疗效、降低毒副作用，而且微生物的生长繁殖对机体自身也具有有益的作用[7，15]。

本实验采用益生菌乳酸菌发酵5味中药，通过平板计数及牛津杯法分别检测了乳酸菌的生长状况及发酵产物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用。结果表明板蓝根、陈皮、苦丁、苦藠均能适应乳酸菌的生长，且均有最适发酵的菌株，说明中药能提供乳酸菌生长所必需的营养物质。抑菌实验表明，板蓝根、陈皮、苦丁、苦藠被特定乳酸菌发酵产物抑菌活性增加，可能是由于乳酸菌促进中药释放更多的抑菌活性成分，乳酸菌利用自身酶系统产生了新的具有抗菌活性的物质，或者微生物自身的代谢产物与中药具有协调抗菌活性[2]。除增加抑菌作用以外，实验还发现乳酸菌RLQ、ZYRLQ、7340、LP、SRG发酵5种中药上清液对大肠杆菌、沙门氏菌抑菌作用不变或无抑制作用，中药甘草被发酵后产物无抑菌作用，原因可能由于乳酸菌将中药中的一些抑菌活性物质转化为无活性的物质，或乳酸菌与中药之间没有相互的作用，或者之间作用后利与弊趋于平衡。罗伊氏乳杆菌发酵板蓝根、陈皮、苦丁、苦藠的上清液对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌都具有明显的抑菌效果，可以作为以后研究以及产品开发的重点候选菌株。

4 小结

选用的5味中药基本适应乳酸菌的生长，乳酸菌对中药的发酵产物抑菌效果是不同的，既能增加抑菌效果，也能降低抑菌效果，或者发酵前后没有变化，表明乳酸菌发酵中药前后成分发生了变化，可以利用发酵产物增加抑菌效果的乳酸菌发酵相应中药，筛选出更好的抗菌药物，应用于畜牧生产中。