提蛋白时煮时间长了（一般加药多久提蛋白）

1. 动物组织

1.1. 超声破碎法

1. 将冷冻的样品取出，用液氮/干冰研磨成粉末；

2. 取0.05g研磨后的粉末加入300ul SDS裂解液，加入蛋白酶抑制剂（PMSF或Cocktail）使其终浓度为1mM；

3. 冰上超声破碎，功率80W，超声1.0s，关闭1.0s，共2min，重复三次（控制低温）；

4. 将溶液在室温下12000rpm离心15min，取上清，并再次离心取上清；

5. 上清液即为组织的总蛋白溶液，采用BCA法[1]测定提取的蛋白浓度并分装后储存于-80℃备用。

1.2. 超声破碎+酚抽提法（动物肠道和海洋动物）

1. 将冷冻的样品取出，用液氮/干冰研磨成粉末；

2.取样品粉末加入0.6mL抽提液，加入蛋白酶抑制剂（PMSF或Cocktail）使其终浓度为1mM；

3. 冰上超声破碎，功率80W，超声1.0s，关闭1.0s，共2min（控制低温）；

4. 加入等体积的酚-Tris-HCl(7.8)饱和溶液，4℃反应30min，期间每5min摇晃混匀一次；

5. 4℃，7100rpm离心10分钟，收集酚上层；

6. 加入5倍体积的预冷0.1M醋酸铵-甲醇溶液，-20℃过夜沉淀；

7. 4℃，11500rpm离心10分钟，收集沉淀；

8. 加入5倍体积的预冷甲醇以清洗混匀，4℃，11500rpm离心10分钟，收集沉淀，重复一次；

9. 以丙酮代替甲醇4℃，11500rpm离心10分钟，收集沉淀，自然风干（约3-5min）；

10. 将干燥后的粉末溶解液于样品裂解液中吹打混匀，室温溶解1小时；

11. 将溶液在室温下12000rpm离心10min，取上清，并再次离心取上清；

12. 上清液即为组织的总蛋白溶液，采用BCA法[1]测定提取的蛋白浓度并分装后储存于-80℃备用。

2. 植物组织

2.1. 酚抽提法

1. 将冷冻的样品取出，用液氮/干冰研磨成粉末；

2.取样品粉末补充抽提液至1ml混匀，至少反应10min；

3. 加入等体积的酚-Tris-HCl(7.8)饱和溶液，4℃反应40min，期间每5min摇晃一次；

4. 4℃，7100rpm离心15 min，收集酚上层；

5. 加入5倍体积的预冷0.1M醋酸铵-甲醇溶液，-20℃过夜沉淀；

6. 4℃，11500rpm离心10分钟，收集沉淀；

7. 加入5倍体积的预冷甲醇以清洗混匀，4℃，11500rpm离心10分钟，收集沉淀，重复一次；

8. 以丙酮代替甲醇4℃，11500rpm离心10分钟，收集沉淀，自然风干（约3-5min）；

9. 将干燥后的粉末溶解液于样品裂解液中吹打混匀，室温溶解1小时；

10. 将溶液在室温下12000prm离心10min，取上清，并再次离心取上清；

11. 上清液即为组织的总蛋白溶液，采用BCA法[1]测定提取的蛋白浓度并分装后储存于-80℃备用。

酚抽提法中抽提液的配置：

10 mL配方：蔗糖 2.4g，NaCl 0.058g，EDTA·2Na 0.146g，DTT 0.02g，0.5M Tris-HCl （pH6.8）2.5mL，0.5M Tris-HCl（pH8.8）2.5mL，然后加ddH2O定容至10mL，充分溶解混匀。

注：酚抽提液需要现配现用。

3. 细胞、菌体

3.1. 细胞和革兰氏阴性菌

1. 取样品约为绿豆大小加入300ul SDS裂解液，加入蛋白酶抑制剂（PMSF或Cocktail）使其终浓度为1mM；

2. 冰上超声破碎，功率80W，超声1.0s，关闭1.0s，共2min，重复两次（控制低温）；

3. 将溶液在室温下12000prm离心15min，取上清，并再次离心取上清；

4. （样品本身没有多余液体和提取液澄清）上清液即为组织的总蛋白溶液，采用BCA法[1]测定提取的蛋白浓度并分装后储存于-80℃备用；

3.2. 革兰氏阳性菌

1. 冷冻的样品取出约绿豆大小，用液氮/干冰研磨成粉末；

2. 研磨后的样品加入300ul SDS裂解液，加入蛋白酶抑制剂（PMSF或Cocktail）使其终浓度为1mM；

3. 冰上超声破碎，功率80W，超声1.0 S，关闭1.0 S，共2min，重复两次（控制低温）；

4. 将溶液在室温下12000prm离心15min，取上清，并再次离心取上清；

5. （样品本身没有多余液体和提取液澄清）上清液即为组织的总蛋白溶液，采用BCA法[1]测定提取的蛋白浓度并分装后储存于-80℃备用。

4. 发酵液、胞外分泌蛋白（细胞培养液）、尿液

4.1. 超滤浓缩（样品超过5ml）

1. 将样品在常温水域中复溶；

2. 每次转移10ml至3KD超滤离心管中；

3. 4℃，6400g离心40分钟，收集截留液，重复上一个步骤直到样品全部用完；

4.加200ul色谱水冲洗超滤管，与截留液混合。此步骤重复三遍或三遍以上，收集残留在滤膜上的样品；

5.取出截留液过夜冻干，冻干后加SDS裂解液和蛋白酶抑制剂（PMSF或Cocktail）；

6. 将溶液在室温下12000rpm离心10min，取上清，并再次离心取上清；

7. 上清液即为组织的总蛋白溶液，上清液和截留液采用BCA法[1]测定提取的蛋白浓度并分装后储存于-80℃备用。

5. 血清、血浆蛋白提取

5.1.血清血浆蛋白提取（去除高丰度蛋白）

1. 取40ul血浆/血清，以结合缓冲液（试剂盒：Binding Buffer）十倍稀释；

2. 除去柱子上的盖子，以纸吸去贮存缓冲液；

3. 除去柱底部的尖咀，放入大小适合的收集管；

4. 加入850ul结合缓冲液，让其靠重力流过柱体；

5. 将柱子放入一个新的大小适合的收集管中；

6. 加入稀释后的样本，让其靠重力流过柱体；

7. 以600ul结合缓冲液清洗柱体；

8. 再次以600ul结合缓冲液清洗柱体收集上三步的洗脱组份，即为去除白蛋白/IgG后的样本真空冷冻干燥后备用；

9. 将冻干的样品加入200ul SDS裂解进行复溶；

10. 将溶液在室温下12000rpm离心10min，取上清，并再次离心取上清；

11. 上清液即为组织的总蛋白溶液，采用BCA法[1]测定提取的蛋白浓度并分装后储存于-80℃备用。

5.2.血清血浆蛋白提取

1.取出柱子平衡至室温。

2.拧开柱子上的盖子，每个样品取10μL血浆（已加入蛋白酶抑制剂）加入到柱中的树脂浆中。

3.盖上柱子上的盖子，上下颠倒直至样品混匀。

4.将柱子放在旋转仪上旋转1h。

5.去掉柱子底端，并将柱子放在2mL的EP管中。

6.拧开柱子上的盖子，在4℃下1000×g离心2min。

7.收集洗脱组分，即为去除血浆中丰度排名前12的蛋白后的样本，真空冷冻干燥后备用。

8.将冻干的样品加入100μL SDS裂解进行复溶。

9.将溶液在室温下12000×g离心10min。

上清液即为样品的总蛋白溶液，进行蛋白浓度测定并分装后储存于-80℃备用。

6. BCA 蛋白浓度测定

6.1. 实验原理

BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即 BCA 工作试剂。在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将 Cu2+还原为 Cu+，一个 Cu+螯合二个 BCA 分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，该水溶性的复合物在 562nm 处显示最大吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

6.2. 试剂盒说明

检测浓度下限达到10μg/mL，最小检测蛋白量达到0.2μg，待测样品体积为1-20μL。在20-1000μg/mL浓度范围内有较好的线性关系。

BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。但受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响，需确保EDTA低于10mM，无EGTA，二硫苏糖醇低于1mM，β-巯基乙醇低于0.01%。这些不适用BCA法的样品，可以使用Bradford蛋白浓度测定法。

6.3. 试剂配制

配制25mg/mL蛋白标准溶液母液:

取1.2mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。

配制0.5mg/mL蛋白标准溶液:

根据试剂盒里提供的方法。

注：蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。

配制BCA工作液按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。根据样品数量计算所需BCA工作液体积，每个样品需要400μL（预测200ul+检测200ul）的BCA工作液，再加上标准品所需2mL，例如10个样品，所需体积为0.4 mL×10+2mL =6 mL，取6 mL BCA试剂A，加入120μL BCA试剂B，混匀，配制成6.12mL BCA工作液， BCA工作液室温24小时内稳定。

6.4. 实验过程

1. 提前至少半小时打开紫外分光光度计（酶标仪）；

2. 将0.5mg/mL蛋白标准溶液按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL：

BSA体积（ul）01248121620PBS体积（ul）2019181612840

3. 加2ul样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释补充到20μL（三次重复）；

注：测量浓度请需要对样品进行稀释，使其的浓度范围在0.5-5 mg/mL 之间，保证样品浓度在线性范围内，一般样品需要稀释5-10倍即可，根据实际蛋白浓度适当调整。

4. 各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置30分钟；

5. 使用紫外分光光度计（酶标仪）测定A562吸光度，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

6.5. 建标准曲线

测得三次重复实验 BSA 溶液的吸光度如下：

编号吸光度1吸光度2吸光度3平均吸光度浓度（mg/ml）00.0000.0000.0000.0000.00010.0210.0300.0290.0270.02520.0470.0260.0530.0540.05040.1070.1040.1030.1050.10080.2080.2160.2110.2120.200120.2730.2740.2740.2740.300160.3670.3620.3710.3670.400200.4470.4500.4470.4480.500

用 Excel 或 orgin 作出吸光度对 BSA 浓度的关系曲线。

图1：标曲

注：每次测浓度标准曲线都要重新建立

6.6. 实验结果分析

得到的吸光度对 BSA 浓度的关系曲线R²值大于 0.99 的时数据较好。如果R²值小于0.99，即测得的吸光度与浓度的线性不可靠，需要重新测定。究其原因可能有以下两点：一是移液枪的操作不是很熟练，二是移液枪在移液过程中存在着气泡，使移的液体体积不准确。

注：本方法测定的结果是默认稀释10倍后检测的，所有检测的样品真实浓度均在自己稀释倍数后面乘以10。

样品蛋白浓度结果分析：

7. Bradford 法测蛋白质浓度

7.1. 实验原理

考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在 488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在 595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下 1h 内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为 0～1 000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

7.2. 试剂配制

(1) 10ml 标准蛋白溶液

浓度： 1mg/ml 牛血清蛋白

配置： 用十万分之一天平称取 0.01g 牛血清蛋白(98%)倒入 10ml 容量瓶中，用 0.15M NaCl 溶液定容至 10ml，室温下充分混合溶解 1 小时，10000rpm 离心半分钟，取上清液。分装成350ul每管-20℃备用。

(2) 500mL 染色剂

浓度： 0.01%（w/v）G250，8.5%磷酸和 4.75%乙醇

配置： 用千分之一天平称取 0.05g G250 于烧杯中，加入 25mL 95%乙醇，使用搅拌子搅拌，再量取 50mL 85%的磷酸溶液，最后去离子水定容至 500mL。配好后用 Whatman1 号滤纸过滤。

保存：在常温条件保存在棕色试剂瓶中三个月，但这段时间可能会出现染料的沉淀，所以每次使用前需混合均匀。

7.3. 实验过程

1. 提前至少半小时打开紫外分光光度计或者酶标仪；

2. 往母液中加入磷酸缓冲溶液（PBS）配制一组浓度分别为 1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.4mg/ml ，0.2mg/ml，0.1mg/ml 的 BSA 溶液 100μL，计算稀释各组需要的 BSA 溶液及 PBS 溶液的体积：

BSA体积（ul）01020406080100PBS体积（ul）10090806040200BSA浓度（mg/ml）00.10.20.40.60.81.0

3. 将配置好的不同浓度蛋白标准溶液30μL加到1mL Bradford工作液中，轻轻颠倒混匀，静止5min；

4. 将3ul的样品用PBS稀释至30mL，加入1mL Bradford工作液中，轻轻颠倒混匀，静止5min；

注：高浓度的蛋白样品要保证稀释后的样品浓度在3.0-5.0mg/ml，所以测浓度之前可以简单的估计一下浓度范围。

5. 将反应好的溶液300μL加入到96孔板的样品孔中（三次重复）；

6. 使用紫外分光光度计或酶标仪测定A595nm吸光度。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度；

7.4. 建标准曲线

编号吸光度1吸光度2吸光度3平均吸光度浓度（mg/ml）10.0000.0000.0000.0000.00020.0450.0510.0460.0470.10030.1770.1880.1840.1830.20040.3580.3620.3390.3530.40050.4710.4910.4780.4800.60060.6490.6390.6040.6310.80070.7500.7480.7420.7471.000

用Excel或orgin作出吸光度对BSA浓度的关系曲线

图2：标曲

注：每次测浓度标准曲线都要重新建立。

7.5. 实验结果分析

得到的吸光度对 BSA 浓度的关系曲线R²值大于0.99的时数据较好。如果R²值较小，即测得的吸光度与浓度的线性不是很好。究其原因可能有以下两点：一是移液枪的操作不是很熟练，二是移液枪在移液过程中存在着气泡，使移的液体体积不准确。

样品蛋白浓度结果分析：

8. SDS-PAGE实验

8.1. 试剂配制

1.0L SDS电泳缓冲液：

Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，SDS 1 g，加去离子水至1 L。

10%过硫酸铵溶液（10%APS）：

过硫酸铵0.1 g，溶解于1 mL去离子水中，此溶液在使用前现配现用。

10ml 2*SDS-PAGE loading buffer：

5mMTris-HCl（pH=6.8）1.25mL，甘油2 mL，10%SDS4 mL，DTT1g，0.1%溴酚蓝500μL，加ddH2O定容至10 mL。

12%的分离胶配制：

ddH2O 2.2 mL，40%丙烯酰胺1.5 mL，1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）1.25 mL，APS 25 μL，TEMED 3 μL。

5%的浓缩胶：

ddH2O 1.3 mL，40%丙烯酰胺0.2 mL，0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）0.5 mL，APS 20 μL，TEMED 2 μL。

考马斯亮蓝R-250染色液：

称取考马斯亮蓝R-250 1 g置于1 L的烧杯中，加入异丙醇 250 mL，搅拌溶解，再加入100 mL冰醋酸（磷酸）并搅拌均匀，用去离子水补足至1 L。最后用滤纸除去颗粒物质后于室温保存。

8.2. 实验操作

1. 根据蛋白浓度的测定结果，向1.5 mL EP管中加入至少含5ug蛋白的样品，并与loading buffer混匀，形成20ul体系；

2. 在沸水中水浴5 mim，取出EP管进行短时离心；

3. 取10ul/20ul样品加入12%的分离胶和5%的浓缩胶的泳道中进行电泳；

4. 首先使恒压80 V电泳，待溴酚蓝进入分离胶后改为恒压120 V至电泳结束；

5. 丢弃浓缩胶，收取分离胶去离子水清洗3次；

6. 加入考马斯亮蓝染色液进行过夜染色；

7. 收集染色液，清水清洗3次加入脱色液进行脱色至蛋白条带和背景清洗。

8.3. 凝胶扫描以及图像分析

染色后的凝胶应用全自动数码凝胶图像分析系统进行扫描，扫描模式为全彩模式，光密度值为300dpi。

8.3.1.正常胶图

图3

图3说明：各泳道重复性和颜色都一致，体现出蛋白提取和定量正确，可以继续试验。

图4

图4说明：前两个为同一物种条带一致，后两个为其他不同物种，总体颜色基本一致，说明定量准确。各泳道条带清晰，故而可以后续实验。

8.3.2.非正常胶图

图5

图5说明：虽然条带基本一致，但第二泳道颜色明显比其他颜色稍浅，说明定量不准确，不可继续试验，需要重新定量。

图6

图6说明：总体颜色一致，条带重复性不好，如果是相同组织说明蛋白提取效果不好，不可继续试验，需要重新提取蛋白。如果是不同组织则可能是样品本身差异。

图7

图7说明：同一组织，总体颜色一致，第4个泳道中间对应其它泳道位置缺少一个明显粗条带，而下面条带明显比其它泳道颜色深，说明在提取时候可能出现了蛋白降解，需要重新提取同时控制低温操作。

9.参考文献

[1].Smith, P.K., et al., Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry, 1985. 150(1): p. 76-85.

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