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文
摘
要
免疫性血小板减少动物模型【北京实验外包】
目前人类免疫性血小板减少性紫癜(immune thrombocytopenic purpura,ITP)的临床试验多建立在临床药物应用的基础上，而不是亚临床研究。这样的试验有可能因为出现意外并发症而被迫中止,因此建立理想的血小板减少动物模型(animal model of thrombocyto-penia)有利于加深对 ITP治疗药物机制和发病机制的理解，并进一步探讨新的诊断方法和治疗方法。
（一）自发性及转基因动物模型
Mizutani H等发现一种具有迟发红斑狼疮倾向的(NZWXBX SB)F1 雌性小鼠。成年后逐渐出现血小板减少、巨核细胞增多，但形态正常，抗血小板抗体(PAIgG)升高，血小板寿命缩短，抗心磷脂酶抗体增高，这些表现符合ITP临床特点。McKenzie 等首创性地将人类FcyRIIa基因转导入自发自身免疫的主动型 ITP模型(W/BF1)中。雌性 NZW 鼠同 BXSB 雄性鼠相交配后，雄性F1发生了系统性自身免疫性疾病，系统性自身免疫性疾病，包括继发于血小板自身抗体的免疫性血小板减少症。杂交第一代小鼠的免疫性血小板减少症能够通过脾切除得到改善。血小板减少在杂交第一代雄性带有 FcyRIa基因表达的小鼠中比缺少，FcyRⅡa基因表达的小鼠表现更为严重。McKenzie 等还将 FcRIA转基因鼠与FcR 敲除小鼠进行交配，检测FcRIA在FcRI及FcRⅢ缺失的情况下发挥的免疫清除作用，结果出现严重的免疫性血小板减少，证实了FcRIA在体内免疫清除中发挥着重要作用。这些在主动型动物模型中的结果证实，FcyRⅡa在体内自身免疫性血小板减少症中是一个重要的受体。
（二）诱发性动物模型
【造模机制】人类巨核细胞表面有着与血小板相同的抗原决定簇，PAIgG分别作用于血小板及巨核细胞。PAIgG导致体内血小板减少，血小板黏附力降低，产板型巨核细胞明显减少，最终引起血小板减少。
【造模方法】选用 BALB/c小鼠，8周龄，18~22g，雌雄各半；豚鼠，3个月龄，雌雄各半。仪器药品：恒温培养箱、EDTA-Na2、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂等。模型制作
1.抗原的制备BALB/c小鼠，乙醚麻醉后，从小鼠心脏取全血，EDTA-Naz 抗凝，梯度离心分离血小板并洗涤，调整浓度为(1~2)×10°/L。
2.免疫方法 取以上血小板悬液分别与等量的完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂混匀成乳白色油包水状做好抗原。第1周取含完全弗氏佐剂的抗原分别注射于豚鼠的后足掌、背部皮下及腹股沟；第2、3、5周取含不完全弗氏佐剂的抗原分别注射于相同部位，前后共4次注射，每次注射至少5点，每点100μ1；第6周从豚鼠心脏采不抗凝全血，1800r/min 离心10分钟后取上清，即为豚鼠抗小鼠血小板抗血清(GP-APS)，-20℃冰箱储存备用。
3.抗血清的处理 APS从-20℃取出，待完全融化后置于56℃水浴30分钟，用等量BALB/C小鼠红细胞至少吸附2次，用生理盐水稀释成1：4浓度,APS备用。
4.抗体效价的检测采用简单的琼脂扩散法：自制10g/L琼脂平板，用打孔器打成梅花形孔环，中间孔滴加免疫浓度血小板悬液，周围孔滴加不同浓度的抗血清，37℃温箱孵育24小时观察沉淀弧，确定最佳血清稀释度。或参照 ELISA法改进，用国产干酶联A蛋白纯品代替碱性磷酸酶蛋白A酶标抗体检测抗血清效价。
5.模型制作将动物随机分为2组，免疫组注射抗血清，空白对照组注射等量生理盐水。急性短期 ITP模型：于 BALB/c小鼠腹腔内一次性注射抗血清 100μl。慢性持续 1Tp 模型：分别在第1、3、5、7、9、11、13天于小鼠腹腔注射抗血清,每次100μl。
6.模型检测 急性短期 ITP模型于注射后3小时、6小时、12小时、24 小时采血,计数血小板、测定 PAIgG。慢性持续 ITP模型可根据具体实验需要选择合适的时间点采血测定以上指标。
【模型特点】免疫组血小板数明显下降,血小板黏附率明显下降。免疫组 PAIgG 显著升高，出血时间延长与空白组比较有显著性差异。
【注意事项】
1.应选同种属同产地来源动物造模由于抗原抗体反应的特殊性，分离抗原和造模所用的实验动物应为同一种属及同一产地来源。
2.应尽可能不要造成溶血 血小板悬液中混有的其他血液成分，主要是红细胞，应尽可能少，否则免疫豚鼠所得的抗血清中会含有大量的抗红细胞抗体，再注射造模动物会引起血清病而致死亡。另外采血的过程中应尽可能不要造成溶血。
3.免疫过程中血小板悬液与弗氏佐剂必须混合完全，乳化充分，否则免疫不易成功。免疫动物注射部位易感染，应注意局部消毒。注射时尽量不要注射豚鼠的前足掌；因为啮齿类动物的前肢对于其摄食非常重要。首次注射尤为重要，抗原的浓度和量一定足够。为了尽可能多的得到抗血清，豚鼠免疫5周结束后，可以2次采血，间隔以1～2日为佳，过长效价会降低，过短血容量不易恢复。
4.对抗血清的处理主要包括两方面 补体灭活和抗原的吸附。用做抗原吸附的纯系动物红细胞制备起来就比较困难，如果不能把血小板从用作吸附的红细胞悬液中分离出去，吸附过程中抗血清的滴度会大大降低。实践证明：如果前面提取血小板的方法成熟，抗原纯度较好，红细胞吸附的过程完全可以省略。
5.抗体效价的检测多采用ELISA法根据相关文献，采用经济简单的琼脂扩散法，基本可以达到检测出抗血清效价的目的。其操作过程类似于肥达氏反应，采用抗血清与生理盐水倍比稀释的方法，获得不同的血清滴度。梅花形孔环是专门用于对比血清稀释度的，中间孔滴加免疫浓度血小板悬液同时应滴加1/4体积的SDS，周围孔滴加倍比稀释的不同浓度的抗血清，37℃温箱孵育24小时，观察沉淀弧，以确定血清的效价。
6.应根据研究需要建立急性或慢性模型急性ITP模型基本一次注射抗血清即可建立，但慢性ITP模型的建立首次注射的量应稍大，并且连续注射若干次后，由于小鼠机体内
【应用范围】该模型为了解免疫性血小板减少疾病的发病机制和探索新的治疗手段提供了一条好的途径。可用于免疫性血小板减少性紫癜的治疗药物筛选。
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