本
文
摘
要
1. 凝胶电泳
包括蛋白和核酸凝胶电泳，首先介绍核酸凝胶电泳：
1） DNA凝胶电泳
在中性PH下，DNA由于其骨架上的磷酸而带负电荷，因此向凝胶另一端的阳性迁移，凝胶能够分离不同大小的DNA片段的秘密在于摩擦力，小分子DNA由于与溶剂和凝胶摩擦力小，所以移动较快，而大分子的DNA由于受到的摩擦力较大，所以移动较慢。
一些较大的DNA分子不适合用普通的凝胶电泳检测，因为其大小与迁移距离已经完全偏离了标准线，而后续开发脉冲场凝胶电泳（PFGE）可以解决这一问题，通过正向相对较长的电脉冲，负向或者侧向相对较短的脉冲。
2） 蛋白质凝胶电泳
蛋白质的凝胶电泳介质为聚丙烯酰胺，为了确定蛋白的多肽组成，需要首先将蛋白质分离为肽链或独立的亚基，通常先用去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）使各个亚基变性，不再相互结合，SDS还有两个附加优点：首先，它可以使所有多肽链的表面都覆盖上负电荷，从而在电泳时都向阳级迁移；其次，遮盖蛋白质亚基原有电荷，使各个亚基在电泳时按照分子质量而不是原有电荷，由于小分子多肽容易穿过凝胶上的小孔，所以迁移速率较快，而大分子多肽则相对较慢。
2. 双向凝胶电泳
有时多肽混合物非常复杂，为了将特定时间特定细胞中成千上万条多肽分离开，我们可以进行蛋白质组学测定，此外为了提高一维SDS-PAGE的分辨率，在二维层面上，可以先在一个PH和凝胶浓度下进行单向非变性（无SDS）凝胶电泳，然后在另一个PH和凝胶浓度下进行过第二向电泳，由于蛋白质所带的净电荷随溶液的PH变化而变化，因此在不同PH下电泳迁移率不同。在不同的聚丙烯酰胺浓度下，根据其分子质量大小，蛋白质也会以不同的迁移率电泳，但是由于缺乏去垢剂，不能将组成复杂的蛋白质各个肽链分开，因此这种方法不能分析单个多肽。
另一种常用有效的方法是双向凝胶电泳，首先蛋白混合物在一个细的管状凝胶中电泳，凝胶中含有一种两性电解质，可在毛细管的两端之间形成PH梯度，带负电荷蛋白质分子在管状凝胶中朝阳极迁移，到达其等电点，即蛋白质的净电荷为零的PH，由于没有净电荷，蛋白质不在向阳性或阴极迁移，这一步叫做等电聚焦，使蛋白质在凝胶中相应的等电点处聚集。
第二步，将管中的凝胶取出，置于平板凝胶的顶端惊醒常规的SDS-PAGE，这时经过等电聚焦初步分离的蛋白质将根据其大小通过SDS-PAGE进一步分离。
3. 离子交换层析
层析是指在纸上将有色物质分离后形成的图案，离子交换层析是利用树脂分离携带不同电荷的物质，带正电荷的树脂吸引包括蛋白质在内的带负电荷的物质，所带负电荷越多，结合就越牢固。
首先制备DEAE-Sephadex悬浮液并装柱，当树脂沉积后加入含RNA聚合酶的细胞粗提物，最后，通过逐渐升高洗脱液的盐离子浓度，将结合在树脂上的物质洗脱，由于盐溶液中的阴离子与蛋白质竞争在树脂上的离子结合位点，从而将蛋白质逐一洗脱下来，随后用组分收集器收集洗脱液，最后分子每一个洗脱组分钟目的物质的含量，同时检测每组洗脱液的离子强度，有助于确定洗脱液的目的蛋白所需要的盐浓度。
4. 凝胶过滤层析
凝胶过滤层析是一种基于蛋白质分子自身大小进行分离的方法，凝胶过滤介质是大小不同的多孔小珠，好比“威浮球”的带孔空心塑料球，将层析柱充满带孔的微型塑料球后，当不同大小的分子通过层析柱时，小分子很容易进入威浮球的小孔内，因此流过柱子的速度较慢，而大分子不能进入柱子内部，因而快速流过柱子，出现在外水体积，即柱子周围的缓冲液体积，不包括柱子内的液体，中等大小的分子选择性地进入一些孔径大小适合的珠子，因此迁移率居中，这样，大分子首先从柱中流出，小分子最后流出，具有不同大小的各类树脂可用来分离不同大小的分子。
5. 亲和层析
最有效的分离办法是亲和层析，其中的树脂含有与目的分子有很强专一性的亲和试剂，树脂可以偶合能够识别特殊蛋白的抗体或含有酶底物的无活性同系物，后一种情况下，酶与同系物紧密结合但不发生反应，当杂蛋白因为与亲和试剂无亲和性而流过柱子后，再用能与目的分子竞争结合的亲和试剂溶液从柱子上洗脱目的分子。
亲和层析的效果取决于树脂上的亲和试剂与待纯化分子间结合的专一性，而当要纯化的蛋白分子是唯一与亲和树脂结合的蛋白质时，甚至都无需层析柱了，只需要简单地将树脂与细胞提取物混合，离心沉淀树脂，弃去上清也留下沉淀在离心管底部的目的蛋白与树脂，然后用缓冲液洗涤沉淀，目的蛋白就可以从树脂中释放出来，然后离心，再次沉淀树脂，这一次的目的蛋白存在于上清中。
Ref:《分子生物学》Robert F · Weaver著
