本
文
摘
要
一 、实 验原 理
从 细胞中分离得到的 DNA 是与蛋白质结合的 DNA, 其中 还含 有大世 RNA, 即核糖核
蛋白。如何有效地将这两种 *** 白分开是技术的关键。
盐溶法是提取 DNA 的常规技术之 一。在制备核酸时，通 常 是 用 研 磨 破 坏 细 胞 壁 和 细胞膜， 使 *** 白被释放出来。利用 DNA 不溶千 0.14mol/L 的 NaCl 溶液而 RNA 能溶于
0.14mol/L 的 NaCl 溶液这一性质可以将 DNA *** 白和 RNA *** 白从样品破碎细胞液中分开。
分 离 得 到 核 蛋 白 后 ，还需 进一步将蛋白等杂质 除 去。去 除蛋 白的方 法有 3 种： ＠ 用 含辛 醇 或 异 戊 醇 的 氯 仿 振 荡 核 蛋 白 溶 液 ， 使其乳化， 然 后离心除 去变 性蛋 白质。用这种 方法处理时， 蛋白质停 留在水相和氯仿相中间， 而 DNA 则溶千上层水相， 用 两倍 体积 95%乙醇溶液可将 DNA 钠盐沉淀出来。 用十二烧基硫酸钠(SOS)等去污剂使蛋白质变性， 从而使其与核酸分离， 也可 从材料 中直接提取出 DNA。用苯酚处理， 然后离心分层， 一样可以将 DNA 与蛋白质分 离开来。这时 DNA 溶于上层水相，蛋 白 变 性 后 则 停 留 在 酚层 内 ， 吸出上层水相， 加入两倍体积的 95%乙醇即可得到白色纤维状 DNA沉淀。反复 使用上述方法多次处理 DNA *** 白溶液 ，就能将蛋白等杂质较彻底 地除 去， 得到较纯的 DNA 制品。本实验采用 CTAB 法从植物幼苗中提取基因组 DNA。
为了彻底除去 DNA 制品中混杂的 RNA 杂质， 可用 RNA 酶进行处理。另外， 生物材料中 还含 有 大堂的脂肪物质和 多糖 ， 这些物质 在用 盐溶液分 离 *** 白 和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可被除去。
核酸纯化目标：纯 化 后 的 核 酸 样 品中 不应 该 存 在对 酶 有 抑 制 作 用 的 有 机 溶 剂 和 过 高 浓度的 重 金属 离 子 ； 其 它 生 物 大分 子物 质 如 蛋 白 质 、 多糖 和 脂 类 分 子 的 污 染 应 降 到 最 低 程 度 ； 排除 RNA 分 子污 染。
操作 注意事项： 尽 世 简 化 操 作 步 骤 ， 缩短提取过程 减少各种有害因素对核酸的破坏； 减少 化 学 因 素 对 核 酸 的 降 解 ， 一般 pH 4-10; 减少物理因素如机械切力、高温对核酸的降解。
提取步骤： 破 碎 细胞， 去除与核酸结合的蛋白质 、多糖 和脂 类分 子， 去除 RNA, 去除盐类、有机溶剂等杂质。方案： 视 具 体 的 生 物材 料 和 待 提 取 的 核 酸分 子特 点 而 定 。
二 、仪 器 设 备
高速离心机、水浴锅、电子天平、冰箱
三、试剂
EDTA-Na2.2H20 , 加入 10ml 1mol/L 的 Tris-HCl(pH8.0)和 0.2ml EDTA、0.2% -硫基
乙醇，加双蒸水 (ddH20 )定容到100ml; (D 2xC TAB提取液（内含 2%CTAB、1.4mol/L NaCl、
25mmol/L 硫 基乙醇和 0.1mol/l Tris-HCI, pH8.0): 取 2g CTAB、8.18g NaCl、0.74g
＠ 氯仿：异 戊 醇 {24:1)
＠ 洗涤缓冲液{70%乙醇，内含 10mmo l/L 乙酸按）： 取 70 ml 无水乙醇和 0.077g乙酸按， 加双 蒸水 定容 到 100ml;
＠ 无水乙醇、70%乙醇；
@ T E 缓冲液： 内 含 10 mmol/L Tris-HCI、1 mmol/L EDTA, pH8.0
四、操作步骤
＠ 将材料在液氮中研磨成粉， 迅速 分装千 Eppendorf 管中， 加入 0.7ml 6·o c 水浴中预热的 2xCTAB 提取液和 20ul b-硫基乙醇， 轻轻转动使 之混匀 ；
＠ 样 品 千 5o· c 溫 浴 45 min, 每 Smin 将 Eppendo rf 管上下颠倒混匀；
© 加 入等体积氯仿异戊醉(24:1), 轻轻颠倒混匀，室溫下放置5min, 6000g 离心 10min。
＠ 上层溶液转入另一个干净 Eppendorf 管中，加入 等 体积 的氯仿异戊醇(24:1), 混匀，
6000g 转离心 5min;
© 重复步骤@ 2-3 次，直至无白 *** 面物质 ；
＠ 将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入 2/3 体积的预冷异丙醇， 轻轻混匀使核酸沉淀下来。在-2o·c 下放置 30min, 4·c 、10000g 转离心 1 0min , 弃上清液；
© 沉 淀用加入1ml 洗涤缓冲液，10000g 离心 1 -2min;
＠ 沉淀用无水乙醇洗 1 次， 10000g 离心 1- 2mi n
