本
文
摘
要
大一时的某次作业，堆在这里，万一有用呢~
包含部分文字复制内容，图片均为转载，侵删。
肯定有不严谨的地方，欢迎各位大佬批评指正！
获取碱基序列
NCBI上有许多种数据库。 GenBank是国际核苷酸序列数据库合作的一部分，该合作包括日本DNA数据库(DDBJ)、欧洲分子生物学实验室(EMBL)和NCBI的GenBank，这三个组织每天交换数据。RefSeqs是一种由NCBI建设的，有检查的不重复的DNA数据库。据说后者更为可靠。
打开NCBI主页面，选GENE，输入基因名称，找到符合要求的基因，点击进入基因页面，即可显示出这个基因的mRNA信息，最后的ORIGIN是CDNA序列。在RefSeqs中，“NG”开头的是染色体基因组序列，“NM”开头的是cDNA序列，“FASTA”是一种基于文本用于表示核酸序列或多肽序列的格式。其中核酸或氨基酸均以单个字母来表示。
设计引物
PCR引物设计，核心目的是为了追求扩增特异性和扩增效率。我们将从以下几个方面考虑问题。
A．引物的长度
引物越长，特异性越好，但是更难与模板链结合，因此更难反应，扩增效率更低。此外，引物的长度还由DNA复制酶决定，并且与退火温度有关
一般的，引物长度为18-30bp；
B．GC含量
Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。Tm值与GC值相互联系，引物的熔化温度（Tm）介于 65°C 和 75°C 之间，当Tm值为72℃时，复性条件最佳。，对应的，目标 GC 含量在 40% 至 60% 之间。
对于上下游引物，两种引物之间应该CG含量与Tm值相差不大。若差别较大，可以添加额外的AT在DNA聚合酶不作用的引物5’端。
C．引物末端（3’）的设计
引物3端不能选择A，最好选择T。引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3端最好选择T。
引物3 端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
不能有GC长链（连续多于两个）。GC长链有可能与模板链上的GC密集区错配，引发错误的反应。
碱基排列，应该防止两个引物3’间的配对，防止生成二聚体，同时应该防止5’与3’配对，防止生成发夹结构。
D．引物∆G值
ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即3’端ΔG值较低，而5’端和中间ΔG值相对较高，因为从5’进行的反应更方便。3端的ΔG值相对要低，但不可过高，引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
E．引物碱基序列
首先，两个引物或者单个引物，尽量不出现互补片段。尽量不出现连续的碱基序列，防止错误结合。
此外，还需要使用BLAST软件进行检测，防止引物与模板链的其他位置结合。
一般的，有许多相关的软件或者网页可以进行辅助设计，比如NCBI中的Primer-Blast或者Oligo软件。以Primer-Blast为例，里面可以自定义引物的起点终点，包含内含子外显子的引物设计，自动BLAST检测，还可以输入自己设计的引物去分析。
准备扩增材料
A． 模板链
一般在DNA聚合酶的说明书上写有要求，以Platinum™ SuperFi II DNA Polymerase为例，若复制质粒DNA，最少需要0.1ng，若复制基因组DNA，最少需要5ng。
B． 缓冲液
包含缓冲体系（比如10~50mM Tris-HCl，MOPS缓冲体系，HEPES缓冲体系），一价离子（比如50mM KCl），二价离子（比如1.5mM ）。
Tris-HCl缓冲液（0.05M，25℃），三羟甲基氨基甲烷溶液，呈酸性，pH为4-6。常见的生物缓冲液。
MOPS，3-吗啉丙磺酸， pH=7.20，是许多生物系统在接近中性pH值时的出色缓冲剂。
HEPES，N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸。它的PH缓冲范围在6.8到8.2区间之内。
缓冲液的一个常见成分是来自KCl的钾离子，其可促进引物的吸附。有时，也可使用硫酸铵代替KCl。铵离子(具有去稳定作用，尤其对于错配引物-模板复合物碱基对之间的弱氢键，因此可增强反应特异性。
镁离子作为DNA聚合酶活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键。此外， Mg2+ 能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷，从而促进引物与DNA模板形成复合物浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
当然，万能的生物公司已经配好了缓冲液体系，直接买就行。
C． dNTPs：
一般的，四种脱氧核糖三磷酸含量应该相同，浓度在200μM左右
D． 引物：
在配制PCR反应体系时，引物加入量应在0.1–1μM范围内。对于含有简并碱基或用于长片段PCR扩增的引物，常用的引物浓度为0.3–1μM。引物浓度过高容易产生错配和非特异性扩增。而引物浓度过低可能会导致目的片段的少量扩增或无扩增
以Platinum™ SuperFi II DNA Polymerase为例，上下游引物浓度均为0.5μmol/L。
计算运行参数
包含三个部分，第一次循环的初始变性，之后不断循环的退火与延伸，最终的延伸。所用时间与对应温度都不太一样。
引物退火时间引物设计工具可以计算 。退火温度可能需要根据扩增结果进行进一步优化。例如，如果结果为无扩增条带或扩增水平很低，则优化时应以2–3°C增量逐渐降低退火温度。但是，如果出现非特异性PCR产物，则以2–3°C增量逐渐提高温度（最高至延伸温度），提高特异性。不同的缓冲液对的 也有不同的影响。
如今，很多PCR仪可以设置温度梯度，这个功能就可以用来实验引物退火时间。
此外，还需参照DNA聚合酶的说明书。以Platinum™ SuperFi II DNA Polymerase为例，一般的：
引物长度大于30bp，引物退火温度与延伸温度相差不超过3°C，则退火和延伸温度可合并为一步：
调整参数方式见PCR仪说明书。
分离纯化产物
电泳，回收，洗脱。
DNA或RNA链有磷酸基团，可以电离。由于结构不断重复，可知带电量与链的长度正相关。在电场作用下，不同片段的电泳迁移率不相同，因此可以通过电泳的方法分离不同长度的DNA片段。常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，凝胶浓度越大，孔隙越小，分辨能力越强，适用于分离更小长度的核酸片段。常使用溴化乙锭EB做染料，荧光强度与分子数量成正比。
分离后，割下产物片段的凝胶，用商业公司提供的胶回收试剂盒回收，超滤柱过滤，dd H2OH_2 O 洗脱即可。
