本
文
摘
要
眼看着基因编辑越来越火，而慢病毒基因表达系统是目前广泛使用的基因编辑操作工具之一，因此慢病毒的包装也慢慢越来越火，成为目前各大实验室比较普遍的实验之一，然而，有不少科研小伙伴表示，慢病毒的包装实验步骤实在是太复杂啦，伤不起!
下面，就为大家详细介绍一下慢病毒包装实验的步骤以及滴度测定，供大家参考。
慢病毒基因表达系统由用于表达特定基因的目的质粒及病毒 gag/pol、Rev 和 VSVG 等组分的包装质粒组成，其中包装质粒提供了病毒基因组 m RNA 包装成完整毒粒所必需的结构蛋白、聚合酶和包膜蛋白。
HIV-1是慢病毒中最具特征性的病毒，第一个慢病毒载体系统即以其为基础构建的。慢病毒载体的构建原理就是将HIV-1基因组中的顺式作用元件和编码反式作用蛋白的序列进行分离。为了降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒的可能性，将包装成分的5’LTR换成巨细胞病毒(CMV)启动子，3’LTR换成SV40 polyA位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上，即一个表达gag和pol、另一个表达env。
实验步骤
一、前期准备：
1)构建含有目的基因的病毒载体，抽提高浓度、高纯度的包装质粒和目的质粒;
2)指数生长的293T细胞(培养条件：DMEM+10%FBS, 37°，5%CO2)
3) 试剂：胎牛血清、DMEM、Opti-MEM、lipo2000
4)仪器设备：荧光显微镜、、生物安全柜、超速离心机
二、细胞分盘
转染前一天，通过胰酶消化传代于10cm 培养皿上，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的80%以上)。将细胞置于含5%CO2的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。
三、转染
1)转染前 1h 换液(用10ml 完全培养基置换旧的培养基)。
2)制备包装质粒和目的质粒与转染试剂的混合物。
a.取无菌5ml EP管，加入1ml 无血清Opti-DMEM，加入8µg 目的质粒和16µg 病毒包装质粒(psPAX2：pMD2.G=1:1)，充分混匀;
b.取无菌1.5ml EP管，加入1ml 无血清Opti-DMEM，将50µl转染试剂溶于Opti-DMEM中，充分混匀，静置5min;
c.将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边滴加边轻轻混匀后在室温放置20分钟，使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合物。
3)取出培养皿，将配置好的DNA-转染试剂混合物加入到培养皿中，轻轻混匀，做好标记，放回培养箱中。
4)6~8h后吸去培养基，用4ml PBS清洗一次后，加入8ml新鲜完全培养基培养。
四、收病毒
转染后每隔24小时收集培养后的上清至50ml离心管，做好标记，并给细胞更换新鲜的完全培养基。最后一次收集病毒液后，将接触过病毒的枪头、离心管培养皿等物品用84消毒液浸泡后丢弃。
五、纯化
1)初纯化：将收集到的病毒上清液于3500rpm，离心10分钟，弃去沉淀，并用0.45μl滤膜对离心后的上清液进行过滤;
2)将过滤好的病毒上清液分装到超速离心管中，两两对应配平衡(相差不能超过0.01g);
3)30000rpm，4°离心2小时;
4)离心结束后，可观察到离心管底一侧壁上有白色的病毒沉淀，可在外侧管壁上将白色沉淀用马克笔圈出，即做上标记。在生物安全柜中打开离心管，小心吸掉上清;
5)每管加入40~100μl PBS，小心地将病毒沉淀吹散重悬;
6)根据需要将病毒重悬液分装，于-80°冰箱中保存。
六、慢病毒滴度的测定
1)取4µl病毒样品，加到4µlDNase I酶反应体系中，将样品于37°水浴1h左右后94°灭活DNase I;
3)稀释标准品质粒设置标准品的拷贝数梯度为105、106、107、108、109 2)加入2µl蛋白酶K于55°水浴1h后94°灭活蛋白酶K，消化病毒表面的外壳蛋白，暴露出病毒的基因组RNA，备用; 拷贝数公式：拷贝数=摩尔数×6.02×1023 =质量÷分子量×6.02×1023
质粒分子量计算：此处可以用代码实现，大家可以自行找相关小工具，将质粒全部碱基输入，选择双链、环状，提交即可自动生成质粒的分子量，单位是“道尔顿Da”，即g/mol
4)配置qPCR反应体系，每个样品和标准品设计3个复孔，qPCR反应体系如下：
qPCR反应程序如下：
6)计算待测样品的滴度：将待测样品的Ct均值带入标准曲线的函数公式，计算所加入的病毒样品模板拷贝数X，再换算成滴度。换算公式为：慢病毒滴度=10X×8(稀释倍数)/µl5)制作标准曲线：以每组标准品的Ct均值为纵坐标Y，其对应的拷贝数的对数为横坐标X，做标准曲线，得出标准曲线的函数公式及R平方值;
温馨提醒：推荐——Biofavor慢病毒包装服务
对于不少科研人员来说，慢病毒包装实验步骤复杂且实验周期长，并且容易出各种问题，为了节省宝贵的时间建议大家选择慢病毒包装服务，巴菲尔生物的慢病毒系统属于第三代慢病毒系统，生物安全性高，采用VSVG包膜，宿主范围广泛，慢病毒滴度高，其病毒滴度可以达到10^9TU/mL。
实验流程
巴菲尔生物的慢病毒载体有CMV、mCMV、CAG、PGK、UbC、EF1a、GFAP、NSE等多种启动子可供选择;而且还有EGFP、ZsGreen、tdTomato、mCherry、EYFP等多种荧光标记蛋白可供选择;抗生素筛选基因有Puromycin、Neomycin、Hygromycin等可供选择。
你只需要提供相关基因信息(基因ID、名称、序列等)，巴菲尔生物将提供完整的实验流程报告、测序文件、实验图片、实验数据等，还可提供慢病毒感染各类细胞及动物的相关实验，很全面了有木有！
我们只能帮你到这里了，剩下的就要看你自己了！
