本
文
摘
要
提质粒是分子生物学中最基本的实验操作。现在都用试剂盒，一般采用的是强碱裂解法，所以常见试剂盒质粒提取步骤大同小异，试剂配方也大同小异，但不见得用试剂盒能提取到特别好的质粒，很多时候，试剂盒的说明，只是让你提取质粒不失败而已，想要提取质量更好的超螺旋态质粒，一个关键字：快。以下这个是快速版本。
一、质粒的提取步骤
1. 取通过单克隆过夜培养的新鲜菌1.5-5ml到新EP管，6000-8000rpm离心1-2min，尽量去上清（看菌长的情况怎么样，一般会养多的，所以低速离心，多丢掉点上清乃至混有上清的菌体也没关系，浪费就浪费了）；
2. 取冰盒，放入加了适当浓度的RNase酶的P1 buffer，在收集的菌体沉淀中加入250μl的P1 buffer，并用移液枪打匀（低速其实就是为了方便三下就迅速打匀，高速离心有轻微伤害，且打匀稍微费点劲而已）；
3. 再加入250μl的P2 buffer，温和地上下颠倒5-10次混匀，会有黏液状出现（像果冻一样，注意不要剧烈震荡混匀，有损伤，且可能导致基因组DNA断裂污染质粒，完全可以不静置，裂解时间长了有损伤）；
4. 迅速加入350μl的P3 buffer，再轻柔地上下颠倒5-10次混匀（迅速加P3和速度不要太快的混匀不冲突，剧烈震荡有损伤）；
5. 有白色絮状或块状出现，12000rpm离心5-10min（这里可以高速一下，免得吸取上清把蛋白等吸进去了，所以，吸取干净的上清就行，和之前一样，浪费了一些就浪费了，不要执着全吸走，我们要质量高的质粒，而不是要多的质粒）；
6. 转移全部上清液到吸附柱，4000-6000rpm离心30s-1min，弃废液（这里最好低速离心，充分让吸附柱吸附，所以看吸附柱情况调整转速和时间）；
7. 加入500μl pH=7.5的washing buffer至吸附柱中，4000-6000rpm离心30s-1min，弃废液（同上，低速慢慢洗）；
8. 重复7步骤再洗两次，如果要去除盐类，可以停留1-2min再离心（加洗液）；
9. 空柱12000rpm离心3-5min（这里一定要高速离心，去掉吸附柱里的残留液体，主要是酒精）；
10. 转移吸附柱到1.5ml新EP管，常温或加热开盖放置15-30min，挥发干净剩余酒精（也别太高温或者时间太长，没酒精味道就行）；
11. 轻轻加入65℃，40-50μl左右预热的EB buffer或者ddH2O至吸附柱覆膜中央，静置2min，再12000rpm离心30s-1分钟，留清液（一般，我们用去离子水就好了。免得后续质谱什么还收到残留胍盐影响）；
用Nano drop 2000 测量DNA含量，符合要求则进行下一步的比如电泳验证，酶切等实验。
二、提取质粒的说明：
1、P1中葡萄糖增大粘度，减少机械剪切力，防止DNA 断裂并保证菌体悬浮；EDTA是螯合剂，与金属离子结合，尤其是钙镁离子，降低DNase对DNA的降解。
2、P2中NaOH与SDS可裂解细胞，并使DNA、蛋白变性并形成交联网状结构而沉淀去除，碱性太强，所以不能时间太长，没必要静置，也不要剧烈震荡，断裂的基因组DNA碎片很可能会和质粒混在一起；
3、P3中醋酸钾缓冲液主要是中和NaOH，且醋酸钾与SDS作用，反应生成十二烷基硫酸钾并带动蛋白质沉淀，然后闭环质粒可以复性，但DNA不能复性；
4、wash buffer主要是清洗掉多余的盐离子，所以可以用移液枪环绕吸附柱冲洗，而洗液里的乙醇会影响后续的酶切或测序反应，所以要空柱离心；
5、配方不同，用的柱子也不同，大概要看一下使用的试剂盒，我上面写的也不能一概而论，比如有的试剂盒就没有葡萄糖，有的就挪动了胍盐，有的有盐酸胍，有的Tris base和Tris HCl混合调整，或者调整了EDTA二钠都有可能。
三、操作注意事项：
0、质粒的试剂都可以自己配置，可以去分子生物学上查，大概是pH适当调整，P1大约调整为8，WB调整为7.5，EB调整为8.5。
1、质粒提取中，要用新鲜的菌液，可以多次提，处于对数期的菌质粒提取率最高，过度培养的菌可能存在菌死亡有杂质，细菌老化且DNA降解，菌液量也要适当，不然容易裂解不充分，严重影响得率和纯度，所以，不必要提取那么多的质粒，干吗用？可以用，够用，质量好就行了；
2、质粒提取中，P1 要悬浮好菌体，要低温保存，不然也影响质粒提取效率，P2里有SDS和氢氧化钠，是利用强碱来裂解DNA并释放质粒，所以时间不能太长，且要温和的颠倒混匀，且不能超过5min，否则可能把DNA也裂解成短片段分子，从而混杂在质粒中；
3、加入P3，操作多个样品时，最好每加一管就混匀一管，P3加入后能恢复pH，产生的絮状块状沉淀主要是蛋白质，被裂解的质粒仍然能还原，但DNA不能。离心后如果还有蛋白悬浮物，可以再次离心，或者延长离心时间，两者我都试过；
4、WB最好pH为7.5，洗脱时最好将移液枪斜着加入，可以去除管壁盐分，避免直接垂直加对覆膜有影响，以免降低抽提效率，也可延长洗脱时间，增加洗脱效果；
5、一定要空柱离心，残余酒精会很大程度上影响质粒得率，也可以空柱离心后再开盖挥发酒精到无味道，增加得率；
6、最后加PH=7.5-8.5的EB或者水，用的体积也对回收有一定影响，预热的EB或偏碱性的去离子水能增加溶解效果，且要加在覆膜中央。室温静置2min，也能增加质粒抽提得率。
7、通常离心时间长一点不会有太大问题，而离心时间不够，容易造成抽提失败，我个人通常在蛋白沉淀时高速离心到8min，以便沉淀完全，空柱高速离心3-5min，其余离心去除溶液通过吸附膜，其实低速30s-1min都够了，自己可以调整，经过实验验证，影响都不大，在使用质量偏差的离心管时，也要注意过高的离心速度也可能导致吸附柱损坏；
8、用Nanodrop检测结果时：
8.1 一般来说，260为核酸，280为蛋白质酚类，230为碳水化合物、多肽等杂质，320或340为溶液样品的浊度和其他因素，应该接近0，如果不是说明有悬浮物。且A260/280比值在1.8-2.0之间，纯DNA的比值为1.8，纯RNA为2.0，A260/230比值大于2.0，如果比值小于2.0，说明被糖类、盐类或有机溶剂污染。
8.2 当 0.5％BSA蛋白质污染时，A260和A280的数值都下降，其结果是260/280的比值略微下降。但同时，蛋白残留会导致A230的数值明显上升，进而显著影响260/230的比值。也就是说，如果样品的260/280比值略低于标准值，但260 /230下降明显，那么就应该考虑污染原因是蛋白残留，而不是胍盐残留。
8.3 酚的最大吸收峰在270nm。酚的残留会增加A230、A260和A280的数值，同时酚的吸收峰与核酸的吸收峰合并后，最大吸收峰会出现在270nm附近。因此当样品最大吸收峰会出现在270nm附近，且260/280=1~1.5, 260/230=1~1.5，那么污染原因就应该考虑是酚残留。
8.4 胍盐会在小于230nm处产生大的吸收峰，进而显著影响260/230比值，但胍盐残留不会影响A260、A280的数值，以及260/280的比值。也就是说，如果核酸样品的260/280符合要求，但260/230<1，那么污染原因就应该考虑是胍盐残留。
最后，提质粒一定要快，快就是王道。
