本
文
摘
要
前言
支原体感染让细胞培养人员付出很大代价，因为它们改变了受污染细胞的形态、活力和代谢特征。支原体是最小最简单的原核生物，它们完全依赖于从宿主中获取营养，因为它们的生物合成能力有限。受到支原体污染的细胞培养物很难被检测出来，因为不会引起pH改变或浊度变化，即使加入抗生素也基本不能阻止这种看不见的威胁。
MycoAlert支原体检测试剂来自Lonza Walkersville有限公司，此试剂基于生化检测来发现某种支原体的酶活力。这些酶的存在提供了一种快速筛选过程，可以非常灵敏的对测试样品进行支原体污染检测。在这一测试中，有活力的支原体被裂解并释放出能与MycoAlert底物反应的酶，催化ADP 转化为 ATP。
通过检测样品中加入MycoAlert底物前后ATP的水平，可以得到其比值并指明支原体是否存在。如果这些酶不存在，那么第二次的读数将不会增加。如果存在活的支原体，它们会与MycoAlert特异性底物反应并产生ATP。接下来的生物发光反应就可以检测到ATP的增加了。
发 射 光 强 度 与 A T P 浓 度 成 线 性 相 关 。MycoAlert试剂的发光信号通过使用来自SpectraMax® L微孔板光度计及包含在SoftMax® Pro软件中的预设模板进行检测。
方法
使用MycoAlert Assay质控进行灵敏度测试100-µL系列稀释的MycoAlert Assay质控(Lonza)样品加于白色96-孔发光多孔板(Porvair)中做3个重复。100 µL MycoAlert试剂(溶于MycoAlert缓冲液中；Lonza)加于每个孔中并在室温下孵育5分钟。孔板置于SpectraMax L光度计中，使用SoftMax® Pro 软件(读数 A) 的 MycoAlert模板以1秒读数时间读取所选孔的读数。100 µL的MycoAlert底物(溶于MycoAlert缓冲液)立即加入到每个孔中并在室温下孵育10分钟。孔板置于SpectraMax L 光度计中以1秒读数时间读取所选孔的读数(读数 B)。仪器设置见表 1。
这些设置都包含在 SoftMax Pro 软件的预设MycoAlert 模板中。MycoAlert比值通过读数B除以读数A计算得到，结果如图 1。
MycoAlert Assay 质控 (MAB 指示 MycoAlert Assay 缓冲液) 不断增加稀释比并在SpectraMax L 光度计上检测到的灵敏度。利用支原体感染的细胞进行灵敏度测试将2 mL感染了猪鼻支原体的人类白血病细胞K562细胞培养上清液从培养瓶中移去。细胞上清以400 x g离心5分钟去除所有细胞残留。(细胞残留会导致 ATP 背景值增加，从而会掩盖低水平支原体感染的检测)。
100-µL澄清的培养上清液置于白色96-孔化学发光板(Porvair)中，做三个重复。100 µL MycoAlert试剂(溶于 MycoAlert缓冲液；Lonza)加于每个孔中并在室温下孵育5分钟。孔板放于SpectraMax L中以1秒读数时间对所选孔进行读数(读数 A)。100 µL MycoAlert 底物(溶于MycoAlert缓冲液)立即加进各个孔中，孔板在室温下孵育10分钟。孔板放于 SpectraMax L中以1秒读数时间对所选孔进行读数(读数B)。
MycoAlert比值通过读数B除以读数A进行计算(见图 2)。MycoAlert assay将未感染培养物的比值设为1以下。感染了支原体的细胞的比值则会高于1 (见图 2)。
使用 MycoAlert (MAB 指示 MycoAlert Assay 缓冲液)，不断增加支原体污染物 (来自支原体感染细胞的培养上清液) 稀释比时，在SpectraMax L 光度计上检测到的灵敏度。结果
因为MycoAlert assay可检测阴性样品中非常低水平的ATP，所以需要用光度计先检测由于灵敏度太高所产生的低水平光信号。Lonza指南里建议光度计能够检测到以1:32稀释比稀释的MycoAlert质控。SpectraMax L光度计向我们展示了MycoAlert Assay质控经过系列稀释到建议的稀释比1:32，检测值依然具有良好的线性。高灵敏度光度计对弱光的检测也证明了其非常适合 MycoAlert 的使用。此款光度计的灵敏度测试用支原体感染的细胞样品做进一步的检测。尽管样品中的支原体数量并不清楚，但是MycoAlert支原体检测与SpectraMax L光度计配合使用给我们提供了一个非常大的检测窗。
总结
来自Molecular Devices公司的SpectraMax L微孔板光度计和SoftMax Pro软件与来自Lonza的MycoAlert支原体检测完美配合，为研究者在支原体检测领域提供快速和灵敏的检测技术。高灵敏和大检测窗保证了轻而易举的检测支原体污染，为细胞培养污染监测工作节省宝贵时间。
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