甲基化位置（cpg序列高度甲基化）

这篇应该是甲基化QC的最后一篇啦。

感谢健明带入门。

我前面已经写完两篇：

QC1:甲基化数据QC：使用甲基化数据计算样本间的相关性

QC2:甲基化数据QC: 使用甲基化数据推测SNP基因型（ewastools工具）

下面补充一下对甲基化样本和CpG位点QC的总流程：

1、导入、加载安装包

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) install.packages("BiocManager") BiocManager::install("GenomeInfoDbData") BiocManager::install("IlluminaHumanMethylation450kmanifest") BiocManager::install("IlluminaHumanMethylation450kanno.ilmn12.hg19") BiocManager::install("IlluminaHumanMethylationEPICanno.ilm10b4.hg19") BiocManager::install("IlluminaHumanMethylationEPICmanifest") BiocManager::install("methylationArrayAnalysis") BiocManager::install("limma") BiocManager::install("minfi") BiocManager::install("missMethyl") BiocManager::install("minfiData") BiocManager::install("Gviz") BiocManager::install("DMRcate") install.packages("knitr") install.packages("RColorBrewer") library(knitr) library(limma) library(minfi) library(IlluminaHumanMethylationEPICanno.ilm10b4.hg19) library(IlluminaHumanMethylation450kanno.ilmn12.hg19) library(IlluminaHumanMethylation450kmanifest) library(RColorBrewer) library(missMethyl) library(minfiData) library(Gviz) library(DMRcate) library(stringr) library("methylationArrayAnalysis")

2、加载数据

dataDirectory <- system.file("extdata", package = "methylationArrayAnalysis") list.files(dataDirectory, recursive = TRUE)

3、加载甲基化注释包

ann450k <- getAnnotation(IlluminaHumanMethylation450kanno.ilmn12.hg19) head(ann450k) ann850k <- getAnnotation(IlluminaHumanMethylationEPICanno.ilm10b4.hg19) head(ann850k)

4、加载样本信息数据

targets <- read.metharray.sheet(dataDirectory, pattern="SampleSheet.csv") targets

5、读取甲基化的原始数据idat

rgSet <- read.metharray.exp(targets=targets)

6、将样本名添加到甲基化数据中

targets$ID <- paste(targets$Sample_Group,targets$Sample_Name,sep=".") sampleNames(rgSet) <- targets$ID rgSet

开始QC~

7、甲基化cgp位点P值过滤

原理：对每一个样本的每一个Cpg位点的总信号(M+U)和背景信号进行比较，可以得到P值。一般认为，越低的P值表示该位点越可靠，P值大于0.01的cpg位点，是质量比较差的位点；

检测P值：

detP <- detectionP(rgSet) head(detP)

结果如下图所示： 红色框框为样本名，蓝色框框为为一个cpg位点的P值。

画每个样本cpg位点的平均P值

pal <- brewer.pal(8,"Dark2") par(mfrow=c(1,2)) barplot(colMeans(detP), col=pal[factor(targets$Sample_Group)], las=2, cex.names=0.8, ylab="Mean detection p-values") abline(h=0.05,col="red") legend("topleft", legend=levels(factor(targets$Sample_Group)), fill=pal, bg="white")

如下图所示：

可以看到，只有最后一个样本的cpg平均P值是超过0.05，也就是说，这个样本的质量是比较差的，后续应该被剔除掉。

导出质量报道： qcReport(rgSet, sampNames=targets$ID, sampGroups=targets$Sample_Group, pdf="qcReport.pdf")

7.1、剔除甲基化中高P值样本

keep <- colMeans(detP) < 0.05 rgSet <- rgSet[,keep] rgSet

这里对P值设定的阈值是大于0.05。 我们只保留cpg平均P值小于0.05的样本，对于P值大于0.05的样本（比如本例的birth.11）应被剔除。 剔除以后，11个样本就只剩下10个样本：

7.2、剔除样本信息中高P值的样本

targets <- targets[keep,] targets[,1:5]

7.3、剔除P值中高P值的样本

detP <- detP[,keep] dim(detP)

8、甲基化标准化

甲基化标准化是为了较少样本间的差异。

有两种包可以进行甲基化的标准化工作，分别为preprocessFunnorm和preprocessQuantile。

但这两个包的用途是不一样的。

preprocessFunnorm包是针对甲基化数据来源于有明显分层的样本，比如癌症样本和正常样本，皮肤组织样本和大脑组织的样本。像这种明显有不同来源的样本建议用preprocessFunnorm包进行标准化。

preprocessQuantile包则针对没有明显分层的样本，比如都是健康人群，都是来自血液样本这种情况。像这种单一来源的样本建议用preprocessQuantile包进行标准化。

使用preprocessQuantile包进行标准化：

mSetSq <- preprocessQuantile(rgSet)

比较标准化前后的样本的beta值分布

par(mfrow=c(1,2)) densityPlot(rgSet, sampGroups=targets$Sample_Group,main="Raw", legend=FALSE) legend("top", legend = levels(factor(targets$Sample_Group)), text.col=brewer.pal(8,"Dark2")) densityPlot(getBeta(mSetSq), sampGroups=targets$Sample_Group, main="Normalized", legend=FALSE) legend("top", legend = levels(factor(targets$Sample_Group)), text.col=brewer.pal(8,"Dark2"))

画出来的图如下所示，左边是未进行标准化的，右边是标准化以后的。

可见，进行标准化后，样本间的差异会缩小。

9、查找标准化后数据可能存在的差异来源

这一步是为EWAS做准备的，我们前面进行了标准化，但标准化的数据不代表就可以完全去除样本批次效应、细胞类型等差异。

如果样本间存在批次效应等可能的混淆因素，在后续进行EWAS分析时极大可能会产生假阳性。

因此我们需要通过主成分分析对标准化的数据进行可视化。确定可能的混淆因素，并在EWAS分析时进行校正。

9.1、通过主成分1、2确认样本间的差异来源

par(mfrow=c(1,2)) plotMDS(getM(mSetSq), top=1000, gene.selection="common", col=pal[factor(targets$Sample_Group)]) legend("top", legend=levels(factor(targets$Sample_Group)), text.col=pal, bg="white", cex=0.7) plotMDS(getM(mSetSq), top=1000, gene.selection="common", col=pal[factor(targets$Sample_Source)]) legend("top", legend=levels(factor(targets$Sample_Source)), text.col=pal, bg="white", cex=0.7)

如下图所示，可以很明显的看到这10个样本被分为三个聚类。

说明即便是前期进行了标准化处理后，样本间还是存在差异，比如样本act_naive.5和naive.1就很明显的在不同的聚类中。

这种差异在进行EWAS分析时是我们不愿意看到的，因此后期进行EWAS分析时，应考虑将他们纳入协变量中。

9.2、通过主成分1、2、3、4确认样本间的其他差异来源

par(mfrow=c(1,3)) plotMDS(getM(mSetSq), top=1000, gene.selection="common", col=pal[factor(targets$Sample_Group)], dim=c(1,3)) legend("top", legend=levels(factor(targets$Sample_Group)), text.col=pal, cex=0.7, bg="white") plotMDS(getM(mSetSq), top=1000, gene.selection="common", col=pal[factor(targets$Sample_Group)], dim=c(2,3)) legend("topleft", legend=levels(factor(targets$Sample_Group)), text.col=pal, cex=0.7, bg="white") plotMDS(getM(mSetSq), top=1000, gene.selection="common", col=pal[factor(targets$Sample_Group)], dim=c(3,4)) legend("topright", legend=levels(factor(targets$Sample_Group)), text.col=pal, cex=0.7, bg="white")

对主成分1,2,3,4画图后如下所示：

可以看到，不同样本按照不同颜色很好地被分层了，说明主成分3,4反应的是细胞类型的差异。

同样的，细胞类型差异在进行EWAS分析时也是我们并不愿意看到的，因此他们在进行EWAS分析时应被一起纳入协变量中校正掉。

10、探针过滤

前面我们根据cpg的P值结果对样本进行了过滤。

现在我们需要对探针进行过滤。

detP <- detP[match(featureNames(mSetSq),rownames(detP)),] #匹配ID keep <- rowSums(detP < 0.01) == ncol(mSetSq) #对P值小于0.01的探针进行计数 table(keep) #统计有多少个探针P值小于0.01 mSetSqFlt <- mSetSq[keep,] #保留P值在所有样本中均小于0.01的探针。 mSetSqFlt

11、移除包含性染色体的探针

keep <- !(featureNames(mSetSqFlt) %in% ann450k$Name[ann450k$chr %in% c("chrX","chrY")]) table(keep) mSetSqFlt <- mSetSqFlt[keep,]

12、移除SNP探针

mSetSqFlt <- dropLociWithSnps(mSetSqFlt) mSetSqFlt

13.1、移除匹配在多个基因组上的探针（如果是450k）

这一步是针对450k的数据，如果你的数据是850k，略过这一步，请看下面850k的工作。

xReactiveProbes <- read.csv(file=paste(dataDirectory, "48639-non-specific-probes-Illumina450k.csv", sep="/"), stringsAsFactors=FALSE) keep <- !(featureNames(mSetSqFlt) %in% xReactiveProbes$TargetID) table(keep) mSetSqFlt <- mSetSqFlt[keep,] mSetSqFlt

13.2移除匹配在多个基因组上的探针（如果是850k）

这一步是针对850k的数据，如果你的数据是450k，略过这一步，请看上面450k的工作。

if (! ("devtools" %in% installed.packages()) install.packages("devtools") devtools::install_github("markgene/maxprobes") library(maxprobes) xloci <- maxprobes::xreactive_probes(array_type = "EPIC") length(xloci) mSetSqFlt <- maxprobes::dropXreactiveLoci(mSetSqFlt)

14.1、重新评估是否已经消除样本间的差异（方法一：minfi包）

par(mfrow=c(1,2)) plotMDS(getM(mSetSqFlt), top=1000, gene.selection="common", col=pal[factor(targets$Sample_Group)], cex=0.8) legend("right", legend=levels(factor(targets$Sample_Group)), text.col=pal, cex=0.65, bg="white") plotMDS(getM(mSetSqFlt), top=1000, gene.selection="common", col=pal[factor(targets$Sample_Source)]) legend("right", legend=levels(factor(targets$Sample_Source)), text.col=pal, cex=0.7, bg="white")par(mfrow=c(1,3)) plotMDS(getM(mSetSqFlt), top=1000, gene.selection="common", col=pal[factor(targets$Sample_Source)], dim=c(1,3)) legend("right", legend=levels(factor(targets$Sample_Source)), text.col=pal, cex=0.7, bg="white") plotMDS(getM(mSetSqFlt), top=1000, gene.selection="common", col=pal[factor(targets$Sample_Source)], dim=c(2,3)) legend("topright", legend=levels(factor(targets$Sample_Source)), text.col=pal, cex=0.7, bg="white") plotMDS(getM(mSetSqFlt), top=1000, gene.selection="common", col=pal[factor(targets$Sample_Source)], dim=c(3,4)) legend("right", legend=levels(factor(targets$Sample_Source)), text.col=pal, cex=0.7, bg="white")

在这里，我们可以看到样本的组别、来源差异相比未标准化和未过滤前，已经减少了很多。

14.2、重新评估是否已经消除样本间的差异（方法二：ChAMP包）

bVals <- getBeta(mSetSqFlt) champ.SVD(beta = bVals , rgSet=NULL, pd=targets, RGEffect=FALSE, PDFplot=TRUE, Rplot=TRUE, resultsDir="./CHAMP_SVDimages/")

计算原理是：先对甲基化beta值做主成分分析，对每个主成分和变量（比如本例中的sample_label,sample_group,sample_source，ID，Array等）进行kruskal.test检验，确定两组或多组的中位数是否存在差异。

如果存在差异，说明变量和甲基化beta值存在相关性，也就是说，变量不能被很好的校正掉，那么，将这些没有被很好校正掉的甲基化数值进行后续分析的话，就很容易产生假阳性。

从上面截图可以看到，sample_label,sample_group,sample_source这几个变量与甲基化主成分显著相关，后续做EWAS分析时应将他们作为协变量纳入分析中，或者用ChAMP包的champ.runCombat函数或者minfi包的sva函数将这些变量进行校正。

15、提取M值和beta值

提取M值（mVals）和beta值（bVals）:

mVals <- getM(mSetSqFlt) head(mVals[,1:5]) bVals <- getBeta(mSetSqFlt) head(bVals[,1:5])

对M值（mVals）和beta值（bVals）进行画图：

par(mfrow=c(1,2)) densityPlot(bVals, sampGroups=targets$Sample_Group, main="Beta values", legend=FALSE, xlab="Beta values") legend("top", legend = levels(factor(targets$Sample_Group)), text.col=brewer.pal(8,"Dark2")) densityPlot(mVals, sampGroups=targets$Sample_Group, main="M-values", legend=FALSE, xlab="M values") legend("topleft", legend = levels(factor(targets$Sample_Group)), text.col=brewer.pal(8,"Dark2"))

收获美美的双峰！

上面的教程大部分是基于minfi包展开的。

实际上，除了minfi包，ChAMP包也可以完成这个工作，ChAMP包更简单。直接四个函数搞定。

如下截图所示。

这里我就不展开讲了，原理跟minfi包一样的，只不过ChAMP包把它封装好了。

champ.filter(beta=myImport$beta, M=NULL, pd=myImport$pd, intensity=NULL, Meth=NULL, UnMeth=NULL, detP=NULL, beadcount=NULL, autoimpute=TRUE, filterDetP=TRUE, ProbeCutoff=0, SampleCutoff=0.1, detPcut=0.01, filterBeads=TRUE, beadCutoff=0.05, filterNoCG = TRUE, filterSNPs = TRUE, population = NULL, filterMultiHit = TRUE, filterXY = TRUE, fixOutlier = TRUE, arraytype = "EPIC") champ.QC(beta = myLoad$beta, pheno=myLoad$pd$Sample_Group, mdsPlot=TRUE, densityPlot=TRUE, dendrogram=TRUE, PDFplot=TRUE, Rplot=TRUE, Feature.sel="None", resultsDir="./CHAMP_QCimages/") champ.norm(beta=myLoad$beta, rgSet=myLoad$rgSet, mset=myLoad$mset, resultsDir="./CHAMP_Normalization/", method="BMIQ", plotBMIQ=FALSE, arraytype="EPIC", cores=3) champ.SVD(beta = myNorm, rgSet=NULL, pd=myLoad$pd, RGEffect=FALSE, PDFplot=TRUE, Rplot=TRUE, resultsDir="./CHAMP_SVDimages/")

甲基化QC工作到此结束啦~

16、总结

minfi流程多、繁琐，胜在轻巧，按着流程走，一般不会出现什么报错。

ChAMP包方便，但如果数据多的话，对电脑的配置要求也很高，我跑3000个样本时，256G，32cpu核是带不动的，经常跑着跑着就被kill了。用几百个样本跑时，就很顺利。

17、致谢

感谢健明分享的甲基化分析入门练习：甲基化芯片的一般分析流程

建议各位刚入门甲基化的同学们可以看看健明在B站的视频，讲的很详细。