本
文
摘
要
在作物中有四种重要的外源基因（DNA）转移方法，即：
（1） 质粒法，
（2） 粒子轰击，
（3） 直接DNA摄取，
（4） 通过微注射。
这些方法也被称为用于遗传转化的DNA递送系统。
这些外源基因转移方法的简要描述如下：
方法#1。质粒方法：
质粒是细菌细胞中发现的染色体外元素。它们独立于染色体DNA进行复制，对细菌的正常生长和功能不是必需的。质粒被用作基因工程中的克隆载体。土传细菌土壤杆菌（Agrobacterium tumifaciens）用于转基因植物的开发。
农杆菌介导的遗传转化包括以下四个主要步骤：
（i） 基因克隆：
一种基因工程技术，用来制造一个基因的多个相同拷贝，称为基因克隆。农杆菌的质粒含有肿瘤产生基因（Ti基因或癌基因）。必须用于遗传转化的外来基因被引入以代替用于克隆的致癌基因。因此，通过质粒的自我复制产生了几个相同的转基因拷贝。
（ii）遗传转化：
转基因（外源基因）在宿主细胞中的转移、整合和表达过程称为遗传转化。为了进行遗传转化，带有克隆基因的细菌在宿主植物的细胞培养或原生质体培养中混合（以百万计）一两天。
在培养基中的数千个细胞或原生质体中，只有少数被转化。换句话说，质粒DNA（外源DNA）可以进入、整合并在原生质体的少数细胞中表达。
（iii）转化细胞的鉴定：
第三个重要步骤是鉴定转化的细胞。标记基因包含在考虑的基因中，以便于识别转化的细胞。通常，抗生素抗性基因（如卡那霉素抗性基因）或除草剂抗性基因用于鉴定转化细胞。
质粒（细菌）混合悬浮培养物或原生质体培养物在含有致死浓度抗生素（卡那霉素）或除草剂的培养基中生长。未转化的细胞将死亡，只有转化的细胞或原生质体才能存活。通过这种方式，可以容易地识别转化的细胞。
（iv）转化细胞的再生：
最后一步是将转化的细胞或原生质体再生成整株植物。将转化的细胞转移到培养基中以再生成整株植物。细胞或原生质体的再生是农杆菌介导的基因转移系统的基本要求。
根癌农杆菌的宿主范围有限。它可以投资约60%的裸子植物和双子叶被子植物。因此，农杆菌介导的DNA转移方法已用于几种双子叶作物的遗传转化。
该方法已成功应用于棉花、马铃薯、油菜、大豆、甜菜、向日葵、烟草、番茄、豌豆、甜瓜、亚麻、花椰菜、胡萝卜豆、苜蓿、甘蓝型油菜、生菜、矮牵牛、杨树、 *** 、草莓、苹果、核桃、黄瓜和其他双子叶植物等多种作物的转基因植物开发。在单子叶植物中，只有芦笋和山药等少数物种获得了成功。
限制：
农杆菌介导的遗传转化有三个主要限制，即：
（a） 宿主特异性，
（b） 体细胞克隆变异，以及
（c） 再生缓慢。
下面将讨论这些问题：
（a） 宿主特异性：
农杆菌的宿主范围有限。它不能侵染单子叶植物作物，尤其是谷物。在饮食中，农杆菌也表现出严重的宿主特异性。这限制了其作为转化载体的用途，仅限于少数物种，其中许多物种可能具有有限的商业价值。因此，农杆菌介导的DNA转移方法不能用于许多作物中转基因植物的开发。
（b） 体细胞克隆变异：
在组织培养中诱导的变异称为体细胞克隆变异。组织培养导致体细胞克隆变异的诱导。由于染色体结构的改变，在细胞和原生质体培养中产生了许多变异。体细胞克隆变异给转化细胞的鉴定带来了问题。
（c） 缓慢再生：
农杆菌介导的DNA转移的第三个问题是细胞或原生质体缓慢再生成整个植物。将细胞或原生质体再生成整株植物比从分生组织和器官培养物再生需要更多的时间。
优势：
农杆菌介导的DNA转移方法有两个主要优点。首先，这种方法对转基因的拷贝数和整合位点有一定的控制，这在粒子轰击中是不可能的。
方法#2。粒子轰击方法：
在这种方法中，外源DNA通过高速金属颗粒输送到植物细胞中。粒子轰击法也称为生物微弹轰击、粒子加速和微弹道学。
这种DNA递送方法的主要特点如下：
（i） 拟使用的植物材料：
在这种方法中，需要可再生的组织或器官进行轰击。通常，分生组织、未成熟胚、胚性愈伤组织和悬浮培养已用于不同作物的DNA递送。在这种方法中，原生质体的分离不是必不可少的。
（ii）用于轰炸的金属颗粒：
通常，金或钨颗粒用于轰击。金颗粒密度大，可以穿透比钨颗粒更深的细胞层。其他合适的金属颗粒包括钯、铑、铂、铱等。金属应不与植物组织发生反应。
（iii）DNA递送技术：
轰击是在粒子枪的帮助下完成的。
粒子枪有两种类型，即：
（a） 火药驱动装置，以及
（b） 氦粒子流入枪。
枪粉装置更麻烦，因为它需要比氦粒子流入枪更多的DNA负载粒子。因此，氦粒子流入枪比火药装置更常用。
钨或金的微小颗粒（1.0-1.5µm）涂覆有感兴趣的DNA。DNA的主要克隆形式，即质粒构建用于涂覆金或钨颗粒。DNA包被的颗粒以这样的力加速，它们应该穿透靶组织的外细胞壁。这些颗粒的一些DNA进入靶细胞的细胞核，并与宿主细胞的DNA结合，从而产生转化。
（iv）转化组织的鉴定和再生：
通过聚合酶链反应（PCR）技术鉴定转化的组织。在几个组织中，有几个组织发生了转变。这些转化的组织在培养基中再生成整株植物，进一步检查基因表达的稳定性。
粒子加速法已用于小麦、大麦、燕麦、水稻、玉米、甘蔗、棉花、花生、大豆、普通大豆、木瓜、向日葵、烟草杨树等多种作物的转基因植物开发。
在粒子轰击法中，将分生组织、未成熟胚、胚性愈伤组织、悬浮培养物、下胚轴等各种植物部分用作不同作物中转基因植物再生的外植体（表31.2）。然而，在这种方法中，分生组织和未成熟胚更常用作外植体。用金或钨颗粒轰击所有上述外植体以恢复转基因植物。
优势：
与农杆菌介导的DNA转移方法相比，粒子轰击法具有一些优势。
该方法的优点如下：
（i） 无主机特定性：
该方法不显示宿主特异性。因此，它可以有效地用于各种植物品种的转基因植物的开发。因此，这种方法允许在单子叶植物和双子叶植物中开发转基因植物。
（ii）简单方法：
粒子轰击法在技术上比农杆菌介导的DNA转移法简单。在这种方法中，不需要分离原生质体。可以轰击各种植物器官，如分生组织、胚胎或叶片，并从中再生转化体。
缺点：
这种方法有两个主要缺点。这种方法的主要缺点是不能控制外来基因的拷贝数和整合位点。其次，高昂的设备成本阻碍了许多研究人员使用这种方法进行DNA转移。
方法#3.直接DNA转移：
直接DNA转移涉及电穿孔或化学融合剂，如聚乙二醇（PEG）和磷酸钙。这种方法用于原生质体。制备具有所需DNA的原生质体悬浮液。然后通过原生质体DNA悬浮液施加高压电流。
电流导致原生质体膜上形成小的临时孔，DNA可以通过这些孔。进入细胞后，外来DNA与宿主基因组结合，导致遗传转化。这种方法只能用于原生质体再生的作物品种。首先用电穿孔法将水稻和玉米转化并再生成整株。
方法4。微量注射：
质粒DNA也可以通过机械手段，即通过也称为微注射的显微针，输送到宿主细胞中。此方法没有主机范围限制。这种方法可以有效地用于不同的作物。然而，在这种方法中，原生质体再生也是基本要求。不幸的是，并非所有作物都能从原生质体中再生。因此，该方法的应用也有限。
直接DNA转移方法不需要专门的设备，因此相对便宜。然而，它比弹道方法更乏味，因为它需要有效的原生质体分离和培养程序，这限制了它的应用。
目前有两种DNA递送系统，即：
（i） 农杆菌介导的基因转移，以及
（ii）用质粒DNA包被颗粒轰击细胞，广泛用于转基因（基因工程）个体的发育。
电穿孔和微注射方法很少用于获得转基因植物。表31.3简要比较了三种外源基因转移方法。
