本
文
摘
要
常见的遗传转化的方法有：农杆菌介导法、基因枪转化法和聚乙二醇-介导法
下边小编为大家一一介绍：
农杆菌介导法
根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefacience)介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。其Ti质粒(Tumor-inducingpla *** id)具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。
农杆菌介导法（Agrobacterium-mediatedtransformation）的具体步骤如下：
Step 1. Ti质粒的构建
利用农杆菌进行遗传转化前，必须对Ti质粒进行改造。
改造的目的有以下几点：
（1）去除T-DNA区的激素基因。因为激素基因的产物会导致转化细胞激素水平的不平衡而引起细胞的无限分裂，阻碍正常植株的再生。
（2）保留T-DNA区的左右边界，尤其是左边界，以保证T-DNA的正常转化。
（3）在去除的T-DNA区，增加至少一个可以在植物体内表达的选择基因，以使转化细胞易于被检测出来。
（4）在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。
（5）在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒，该基因只能在细
菌中表达，而不能在植物中表达。
Step 2. 外源基因的转化
除Ti质粒外，发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的Ri质粒(Root-inducingpla *** id)也已成为植物基因工程载体家庭中的新成员。
发根农杆菌感染植物伤口，向目的植物转入Ri质粒中的T-DNA，经一段时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。发状根没有向地性，可在无激素的培养基上培养生长，生长迅速并产生许多分枝，其增长速度一个月可增殖数倍到数百倍。发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖于其菌体中的Ri质粒。例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向分化细胞中才能产生的有用次生代谢物质等。
Step 3. 外源基因的转化
一般而言，农杆菌只感染双子叶植物；但利用Ti质粒作载体已将外源基因导人了水稻、玉米、吊兰、石刁柏、香蕉等某些单子叶植物中。农杆菌介导的遗传转化技术简单，易于掌握，对植物受体要求不严，绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物的组织或器官均可，且转化频率较高，转化周期较短，是目前应用最广的一种植物遗传转化方法。
农杆菌叶盘法转化的主要操作：
（1）无菌受体材料的准备
（2）配制培养基：预培养培养基、共培养培养基、筛选培养基、生根培养基
（3）受体材料预培养
（4）农杆菌培养
（5）侵染
（6）共培养
（7）选择培养
（8）继代选择培养
（9）生根培养
比如：对丝石竹幼茎中段、茎段切口、叶片和愈伤组织，用注射器针刺接种109个/mL发根农杆菌菌液。在含500μg/L羧苄青霉素的MS基本培养基上25℃暗培养诱发毛状根。将从接种位点长出的毛状根剪成1-1.5cm小段，毛状根小段脱分化形成愈伤组织，在不含激素、蔗糖浓度2％的培养基上可获得再生植株。冠瘿碱检测结果表明毛状根、愈伤组织和再生植株都含有由发根农杆菌Ri质粒T-DNA编码合成的农杆碱和甘露碱。由此证明Ri质粒T-DNA *** 入寄主细胞的核基因组中，当植株再生时被稳定地传递给子代(王敬文等，1992)。
基因枪转化法
基因枪法（Microprojectilebombardment）又称微弹射击法，是由Klein(1987)等建立的。他们利用超声波使外源DNA液均匀地包裹钨弹(0.2-2.0μm)，利用手枪的动力原理发射出微弹与DNA的复合体，击中靶细胞，穿透细胞壁和原生质体膜，为进一步整合到基因组提供机会，实现外源基因在完整组织中的表达。根据基因枪的动力原理，目前至少有6种不同类型的基因枪：火药基因枪、高压放电基因枪、压缩气体基因枪、粒子流基因枪、微靶点射基因枪和气枪基因枪。
基因枪转化的操作包括以下6个步骤：
（1）靶细胞或组织的预处理，主要是调节渗透压；
（2）微粒子弹的制备，将外源DNA液包裹到金属颗粒上；金粉和钨粉是基因枪转化中最普遍采用的金属颗粒。钨粉比较便宜，但与DNA结合时间过长会催化性降解DNA并对某些类型细胞有毒害作用。金粉大小比较一致，不会引起DNA降解，对细胞也无毒害。
（3）装备基因枪；
（4）轰击；
（5）过渡培养，在不加选择压的培养基上培养一两周，以利于靶细胞的恢复和外源基因的充分表达；
（6）筛选培养或直接分化再生植株。
基因枪法已成为继农杆菌介导法之后的第二大基因转化方法，尤其在禾本科作物上应用更为广泛。例如：美国康乃尔大学的Sanford(1990)利用“基因枪”把目的基因射入桃的胚胎愈伤组织、胚轴、子叶、茎尖和叶片，进行直接转化，并检测到GUS基因在这些组织中的瞬间表达。基因枪曾成功地转化了小麦、玉米、水稻、兰花等单子叶植物和云杉等裸子植物，也曾将外源DNA导入线粒体和叶绿体中。目前存在的主要问题一是转化效率普遍较低；二是基因枪的造价高，转化成本也较高。
聚乙二醇-介导法
聚乙二醇(PEG)介导（PEG-mediatedtransformation）法与PEG诱导原生质体融合的机理相似，不同的是后者发生在原生质体之间，而前者发生在原生质体与DNA之间。在高浓度的二价钙离子(Ca2+)和高pH值的条件下，略带负电的高分子PEG可能促进DNA向原生质体膜沉淀，或参与原生质体的内吞作用下，使外源DNA分子进入原生质体和细胞核，并整合到染色体上。
Krens(1982)等用这种方法首先实现了烟草的遗传转化。用PEG介导法转化诸葛菜子叶及下胚轴原生质体，系统研究了转化过程及其影响因素。以诸葛菜下胚轴原生质体为受体，PEG介导的主要步骤如下(周冀明等，1996)：
（1）将下胚轴切成0.5mm小段，在CPW-13mol/L中质壁分离1h，于25-28℃往复式摇床(45r/min)上酶解12h。
（2）200目尼龙网过滤，500r/min离心5min，收集原生质体。同样条件下CPW-9mol/L洗两次，沉淀的原生质体重新悬浮于2mLCPW-9mol/L中。
（3）在10mL离心管中加入8mLCPW-21S溶液，再缓缓加入上述2mL原生质体悬浮液，离心5min(600r/min)。
（4）小心吸出漂浮于溶液界面间的原生质体，重新用CPW-9mol/L离心洗涤一次，可得纯化原生质体。
（5）将纯化后的原生质体以(2-5)×106/mL的密度悬浮于1mLMaCa-1中10min，加人25μL质粒DNA静置10min，再加入PEG(相对分子质量6000)至终浓度13.3％混匀，室温静置30min，轻轻混匀后静置10min。
（6）用MaCa-2稀释至10mL，离心收集，并用MaCa-2和原生质体培养基各洗一次，最后调整密度至5×104/mL，28℃暗培养。
（7）培养一定时间后分别向培养基中加入一定量的潮霉素进行筛选。研究结果表明，最适质粒量为25-30g，PEG浓度为15％，pH值8.0。
PEG法是进行基因直接转移的普遍方法，成本低廉，效果稳定。PEG法转化原生质体的频率虽然较低，但结合PEG融合细胞、高pH值、热激和原生质体同步处理等其他细胞工程技术的综合处理，可提高转化效率。其中的影响因素较多，如植物品种及其原生质体再生系统的效率，外源基因的浓度与构象，携带DNA，PEG溶液，加人PEG和DNA的顺序(先加DNA好)，介质中二价阳离子(Ca2+)的种类和浓度，转化细胞的筛选方法等。
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