基因敲除的手段（基因敲除作用）

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基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除两种。

1、完全基因敲除

通过基因敲除技术完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。

CRISPR/Cas9基因敲除技术

CRISPR/Cas9系统由核酸酶Cas9和单链向导RNA (single guide RNA, sgRNA)组成。Cas9蛋白具有两个核酸酶结构域——RuvC样结构域和HNH结构域（RuvC结构域负责切割靶向链，而HNH负责切割与sgRNA互补配对的非靶向链），它可以在DNA的特定位置引入DSBs。sgRNA来源于反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）和CRISPR RNA（crRNA）。每个crRNA包含一个保守的与tracrRNA互补的重复序列和一个与外源DNA互补的20 nt的转录间隔区。tracrRNA与crRNA互补后结合Cas9蛋白，形成CRISPR/Cas9-sgRNA复合物，在基因组的目标位点产生双链断裂。

图1. CRISPR/Cas9系统的结构成分（Sun J et al. Brief Funct Genomics. 2020;Liu C et al. J Control Release. 2017）

TracrRNA/crRNA通常被设计成单链小片段的向导RNA—sgRNA。sgRNA主要包含两个关键片段：3端的双股RNA结构与Cas9蛋白结合，5端的引导序列与目标DNA序列结合。

与TALENs相比，CRISPR/Cas9具有成本低、效率高和简单易用等优势，因而被人们广泛应用。下表所列为TALENs和CRISPR/Cas9两种技术的比较：

2、条件型基因敲除

通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。其中，尤以 Cre/Loxp 系统和FLP/FRT系统应用最为广泛。

Cre/LoxP重组酶系统

包含两个部分：Cre重组酶及其特异识别的LoxP位点。Cre 重组酶是一种位点特异性重组酶，可介导两个34 bp的LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点之间的序列或基因被删除或者倒转。LoxP位点包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向。

图2. Cre/LoxP系统（Mclellan M A et al. Current Protocols in Mouse Biology, 2017）

Cre/LoxP重组系统诱导基因重组的方式主要有以下4种：

①两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶敲除loxP间的序列。

②两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反，Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转。

③两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换或染色体易位。

④四个loxP位点分别位于两条DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导loxP间的序列互换。

图3. Cre/LoxP重组系统诱导基因重组的方式

FLP/FRT 重组酶系统

也是位点特异的重组系统，其原理与 Cre/LoxP 重组系统相似。由FLP重组酶介导两个FRT位点之间DNA序列的重组。FLP重组酶的剪切只发生在相同序列的FRT之间，不同序列的FRT之间不发生重组。FLP/FRT重组酶系统效率较Cre/LoxP重组系统低，其应用受到一定限制，常与其它系统联合使用，以实现较为复杂的多重表达载体的构建，或者是目的片段的剪切。

它莫西芬（ *** ）控制的重组酶系统

由它莫西芬（Tamoxifen，一种雌激素受体分子药物）调节的重组酶（CreER和FlpER）是一种更加精准的诱导体系。以CreER重组酶为例，Tamoxifen不给药时Cre-ER融合蛋白的ER部分与HSP90蛋白相互作用，阻止融合蛋白进入细胞核（图4A）。Tamoxifen给药后，Tamoxifen分子干扰Cre与HSP90的相互作用，使Cre迁移到细胞核。一旦进入细胞核，Cre重组酶就可以进行重组（图4B）。

图4. Cre-雌激素受体(ER)融合蛋白诱导Cre-loxP系统的工作原理（Mclellan M A et al. Current Protocols in Mouse Biology, 2017）