本
文
摘
要
新冠疫情爆发后，mRNA疫苗的快速研发上市和其具有的安全性、精确性等优势，使其在抗击新冠疫情中起到了重要的作用，并推动了整个mRNA赛道的持续升温。尽管mRNA技术在生物制药领域中的应用前景十分广阔，其仍然面临着许多工艺难点。从下游的生产纯化角度来说，不论是线性化的pDNA还是mRNA分子本身，其特点都区别于传统的以蛋白为主的生物大分子，因此在下游纯化工艺的选择上，需要探寻更适合pDNA和mRNA的纯化工艺，并且可以满足简单、快速且可以大规模生产的需求。因此，整体柱层析技术成为这一领域当中的主流纯化技术。
整体柱层析技术的特点
整体柱（monolith）是一种对流相互作用介质（CIM，Convective Interaction Media）。这种层析介质的内部不是由颗粒装填而成，而是一块完整的整体。这个整体的内部布满了相互连通的管道，这些管道的内径大而均匀（一般有1.3、2和6 µm三种类型可选），因此，液体可以在整体柱内部均匀分布，流速快、阻力小。
因此，整体柱层析作为新一代的层析技术，具有如下特点：
高载量（特别是生物大分子）
整体柱的传质方式是对流，而传统颗粒填料的传质方式主要是扩散。对流相比扩散而言其传质速度要更快，特别是对于体积较大的生物分子（如mRNA）。并且由于传统颗粒填料的内径较小，因此较大的生物分子难以进入。整体柱在结合生物大分子时具有明显的优势。并且其载量不会随着流速的升高而下降。
高流速
由于整体柱内部管道相互连通，且内径大而均匀，因此，液体可以在整体柱内部均匀分布，反压低、流速快，从而实现高通量。
高分辨率
由于传统填料是依赖于颗粒的堆叠装填，其颗粒之间就会形成间隙，这些间隙会导致湍流产生，湍流会使分辨率下降。而整体柱由于是互联互通的流路，可以很好的避免这一问题，从而实现高分辨率。
低剪切力
同样，由于湍流的存在，会在湍流和主流体方向之间产生明显的剪切力，而整体柱层析不存在这一问题，对于剪切力敏感的mRNA更加适用。
无需装柱
整体柱是整体制作好的，因此无需装柱，省时省力并可重复使用。
基于这些特点，整体柱层析成为mRNA下游纯化工艺的首选，既温和又高效。
整体柱层析技术在mRNA纯化中的应用
pDNA纯化平台
线性pDNA是体外转录过程的起点，用于合成mRNA。赛多利斯整体柱创新开发了CIMmultus™ HiP² Pla *** id Process Pack™平台，该平台由一个DEAE阴离子整体层析柱和一个C4 疏水整体层析柱组成，可用于从实验室开发到放大生产的pDNA纯化工艺。
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捕获阶段：阴离子交换层析-CIMmultus™ DEAE，可富集pDNA，并去除大部分HCP, mRNA和基因组DNA。
裂解和RNA沉淀后，用CIMmultus™ DEAE实现对所有pDNA亚型的捕获
精纯阶段：高配体密度丁基疏水相互作用层析-CIMmultus™ C4 HLD，可进一步区分开环（OC）、线性和超螺旋（SC）pDNA亚型。
在CIMmultus™ C4 HLD上进行线性pDNA的纯化
该工艺平台能够去除大部分污染物（RNA、宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白、内毒素）并获得高纯度的用于体外转录反应的pDNA。完整纯化工艺结果表明，该工艺平台可实现：
✓ 回收率＞80%
✓ 杂质去除率＞99%，完全满足法规要求
✓ 工艺时间极短
✓ 容易放大到大规模生产，8L层析柱单次运行可以生产48g药用级pDNA
下图显示了整体柱层析工艺比传统填料层析在pDNA生产方面的优势。整体柱减少了工艺时间，降低了缓冲液消耗，使每克pDNA的生产成本大大降低。
pDNA分析平台
CIMac™ pDNA分析柱联合PATfix® HPLC分析平台作为pDNA产品质控分析的重要工具，可对pDNA生产全过程进行检测。单个分析柱可在10min内完成pDNA的过程控制或最终控制，同时监测其他杂质（如RNA）的去除效果，确保终产品符合质控标准。在柱性能不损失的的条件下可进行1000多次样品分析。
CIMac™ pDNA分析柱第1次和第200次进样后对碱性裂解液中的pJ质粒分析（1-流穿，2-RNA和其他杂质，3-oc pDNA，4-sc pDNA）
mRNA纯化平台
针对不同的mRNA工艺阶段，可以采用不同的整体柱类型。下面给大家介绍四种适用于mRNA纯化制备的“大白”。
捕获阶段（方案一）：亲和层析-CIMmultus™ Oligo(dT)
可特异性捕获带有polyA尾部的mRNA。在高盐条件下上样，mRNA的polyA尾部可以与整体柱基质上的oligo dT配体相互作用，高盐的条件使得带负电荷的骨架之间的静电排斥减少，加强了T-A碱基对的氢键作用，从而实现结合。其他非带polyA尾的mRNA组分流穿。
使用CIMmultus™ Oligo(dT)对含有polyA尾部的mRNA进行捕获（B/E模式），其他杂质流穿
捕获阶段（方案二）：具有氢键作用的阴离子交换层析- CIMmultus™ PrimaS
与传统阴离子交换柱不同，CIMmultus™ PrimaS整体柱带有的正电荷使其具有一些阴离子交换行为，但氢键又使其具有选择性。常见的阴离子交换柱需要加热至50℃–70℃温度范围，才能洗脱大分子mRNA。对于CIMac PrimaS只需要在室温条件下，在递增的pH梯度中纯化ssRNA，从溶液中分离大分子单链mRNA（ssRNA），特别是当mRNA没有polyA尾部的时候。同时，他可以去除dsRNA、DNA、蛋白和内毒素，并将ssRNA按照由小到大递增顺序分级分离，因此，可作为多步纯化工艺流程中的高分辨率捕获。
使用CIMmultus™ PrimaS对mRNA进行捕获，pH梯度洗脱
精纯阶段（方案一）：高配体密度丁基疏水相互作用层析-CIMmultus™ C4 HLD
利用疏水相互作用纯化核酸。样品在高盐的条件下进行上样，通过递减盐梯度进行洗脱。大多数DNA、dsRNA和短转录物在完整ssRNA之前洗脱。大多数蛋白和聚集体与层析柱结合得非常牢固，会在清洁步骤通过NaOH予以去除。其作为精细纯化方法效果较好。
使用CIMmultus™ C4 HLD对mRNA进行精纯，递减
盐梯度洗脱
精纯阶段（方案二）：反相层析-CIMmultus™ SDVB
利用反相层析的高分辨率，可以实现对dsRNA和不同长度的ssRNA进行精细分离。
使用CIMmultus™ SDVB对mRNA进行精纯
mRNA分析平台
CIMac PrimaS™分析柱联合PATfix® HPLC分析平台，可以以非常短的梯度实现分离NTP、加帽试剂、酶、DNA模板和mRNA等IVT组分。
使用多类型检测器PATfix®测定IVT混合样品组分
