本
文
摘
要
柱层析方法是有机实验室中最有效的分离提纯手段之一，俗称过柱子，是一种快速且（通常是）简单的分离复杂混合物的有效方法。
柱色谱和薄层色谱的原理一样，但它可以用于制备量物质的分离。因为我们是用压缩空气将溶剂推过柱子，故称其为快速柱色谱。这不仅使分离效果更好，并且可缩短过柱时间。
今天小曼给大家分享一下麻省理工学院化学实验室快速柱色谱层析方法总结。
制备和操作快速柱色谱流程
1) 确定重量
确定干燥、不含溶剂的待分离混合物的重量。
2) 确定洗脱液极性
用薄层色谱选取溶剂体系，确定洗脱液的极性，使Rf 值处于 0.2～0.3 之间，但如果混合物复杂，这可能不太好实现。在比较复杂的情况下，可能需要借助梯度洗脱的方式，简单地说，就是在纯化洗脱的过程中不断提高溶剂的极性，从而将待分离混合物分离纯化。
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3) 确定样品上柱的方法
确定样品上柱的方法通常有三种选择：净试样法，溶液法或硅胶吸附法。
净试样法：如果样品是非粘性油状物，使用净试样法最为容易。可以用一个长的滴管过滤器将液体引入色谱柱中，然后用预先确定的溶剂体系进行淋洗，把所有组分洗入柱子中。
溶液法：净试样法有时可能会引起分离柱断层。因此，对于液体和固体，更为普遍的方法是将样品溶于溶剂中，然后将溶液加入分离柱。最理想的状态是，混合物中所有组分在该溶剂体系（通常是戊烷或己烷）中的Rf为0。这在多数情况下是难以实现的，所以可选用只移动混合物中一个化合物的溶剂，或者可以简单地用所选择的洗脱液。
硅胶吸附法：最后一个方法是将化合物吸附在硅胶上，这对部分液体和所有固体都是适用的。注意：硅胶是酸性的，因此这一步骤将会破坏一些对酸敏感的化合物；当然，也可以选择中性或者碱性氧化铝代替硅胶粉。
4) 确定合适的硅胶和化合物的比例
对于简单的分离，通常要求两者的比例为 30~50：1（重量比）；但对比较困难的分离，需要的比例高达 120：1。
5) 选取合适的分离柱
所需用的硅胶量决定了分离柱的尺寸，是使用短而粗还是长而细的分离柱，迄今为止还没有定论。一般会结合根据混合物体系，对于易分离的体系一般选择装柱较短，这样可以减少过柱时间，提高过柱效率；对于不易分离的体系，一般选择填装量长一点，选长柱，可以使分离效果更好。
6) 选取合适的收集用试管
将硅胶体积除以 4，然后选取能装下这个体积的试管就可以了（200mL 的硅胶对应于 50mL 的组分）。
7) 组装柱子
一旦选定了分离柱，需要堵住活塞底端以避免硅胶的流失。通常，用一小团棉花塞住，在通风橱中填充分离柱。考虑到要用大量挥发性溶剂，以及干燥硅胶对于健康的危害，不允许在通风橱外进行柱的操作。检查并确定柱子是否完全垂直，倾斜的柱子不利于分离。组装好后关上活塞并且加上几英寸高的洗脱液。用漏斗向分离柱中加入一些沙（干燥并且经过洗涤的）。目的是在塞堵物上铺一薄层砂（不超过 1cm），这样可以避免硅胶落入收集瓶中。
8) 拌硅胶
量取适量的硅胶，最安全的方式是在通风橱中量取。硅胶的密度大约是0.5 g/mL，因此可以直接用烧杯量取（100g＝200mL）。不要让硅胶的体积超过烧杯的 1/3，在刚量取的硅胶中加入至少1.5倍体积的溶剂，将其制成浆状，用力振荡和强烈搅拌，使其充分混合，并且除去硅胶中的气体（气泡的存在将会使分离柱的效率大打折扣）。
9) 装柱
用漏斗小心缓慢地将浆状物移入分离柱中，注意不要破坏下面的沙层。注意在灌浆的过程中不时地停下来并且摇动浆体，以确保硅胶混合均匀。灌浆结束后，用洗脱液反复冲洗烧瓶几次，并且将余下的溶剂硅胶混合物加入到分离柱中。用滴管和洗脱液将黏附在柱子顶部边缘上的硅胶冲洗到溶剂层中。
10) 压柱
当所有的硅胶都被洗离柱壁，打开活塞，用压缩空气给柱加压。柱内的硅胶将会压缩到原来高度的一半左右。检查以确保柱子的顶段平坦，如果不平，必须重新搅拌，然后沉降下来。在加压下，加入过量的洗脱液，用铅笔头或橡皮塞轻轻敲打柱子，这将使硅胶颗粒填充得更加紧密。收集从柱子中流出的所有洗脱液，在加入化合物之后重复使用。
注意：切记不要让溶剂液面低于填充层。
11) 上样
当柱子填充好以后，在硅胶的顶部加入石英砂作为保护层。沙层需要填充的比较平整，厚度约在 2cm 左右。这在添加溶剂时起到保护柱子的作用——当溶剂加入过快时，如果没有沙层的保护，溶剂可能会破坏填充硅胶的平整的表面（因此影响分离效果），在溶剂还没有达到沙层之前，可以用压缩空气促使溶液层下降。小心地向分离柱中加入化合物——当添加液体时，确保是沿柱子的壁面加入，而不要直接滴加在柱的顶段。当冲洗含有混合物的烧瓶时，小心地一次性地将满满一滴管淋洗液加到分离柱中。然后打开活塞，当液体下降到填充物的顶段时关掉活塞。如此冲洗烧瓶三次。对沉积在硅胶上的混合物，还要再加 2cm 厚的保护沙层。
12) 加入洗脱液
关闭活塞，将第一个试管放在柱子的出口下面。小心地在分离柱中加满洗脱液。开始时可以用巴斯德球管加入溶剂。当加入了 1cm 高度的溶剂之后，最好打开活塞。继续用滴管滴加溶剂，直到溶剂高于柱内的填充层几个厘米。可以通过漏斗从锥形瓶中加入溶剂——缓慢地让它沿柱子壁加入。一定要有耐心，不要破坏柱内填充物的顶段。
13) 加压过柱
当把洗脱液装满分离柱之后，就可以开始“过柱”了。快的流速将使分离更好地进行。调整空气压力使达到一个快的流速——但不能过快，保持溶剂逐滴滴下即可！保持压力，在收集试管装满后换上一支新的试管，注意随时向柱内补充溶剂。
14) TLC点板
用TCL跟踪柱子的分离结果。一边收集样品，一边进行薄层色谱分析，对照标准物质判断产物分离情况。对于一些新手可能会有一些忙乱，因此，新手操作者要时刻观察色谱柱分离进展，最好在一开始便减低气压（甚至完全去除）。
15) 梯度过柱
当操作梯度洗脱时，先用一种溶剂以保证具有较大Rf的化合物先从柱中被洗脱。当极性较小物质被安全地洗脱到收集烧瓶之后，便可以更换一种极性更大的溶剂继续洗脱。注意：逐步提高溶剂的极性。过于急速的极性变换可能会使硅胶分裂——就像电影里可怕的地震场面一样，柱内的填充层出现裂缝。这对最终的分离将会非常不利！因此，以每 100mL（或更多）溶剂中增加5％左右的极性，直至达到所希望的极性。然后，用该种极性洗脱液洗脱，直到目标化合物被洗脱出来。
16) 洗柱
当确定所有目标化合物都已经从柱内被洗脱的时候，就可以将每样东西收拾起来了。首先，在分离柱的底端放置一个大烧杯，然后用一个夹子切断联通分离柱的压缩气体的气路。让气体将剩余的溶剂全部压出柱子，然后干燥硅胶（从分离柱中移出硅胶比较困难，除非它是完全干燥的）。
17) 产物富集
当分离柱在干燥之时，可开始将组分合并起来。用薄层色谱来确定哪个试管中含有所需的纯样品。将相似纯度的组分合并放在大的圆底烧瓶中，并用旋转蒸发仪进行浓缩。对于费时较长的柱子，可在柱分离过程中就合并流出的组分，以加速进程。当完全除去溶剂后，就可以用质谱和核磁分析所得到的化合物了。
