本
文
摘
要
前言
本文是为欲使用 Anki 等记忆软件记忆高中生物相关知识的同学准备的，将大量节省同学们制作卡片的时间，从而能够专注于知识点的学习，不因琐事而纠缠不清。
本文内容均来自人教版生物选修3课本专题1。
正文
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，賦予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。
“工欲善其事，必先利其器”。我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉，就是通过精心设计，用“分子工具”构建成的。培育抗虫棉首先要在体外对含有抗虫基因的DNA分子进行“切割”、改造、修饰和“拼接”，然后，导入棉花体细胞内，并使重组DNA在细胞中表达。实现这一精确的操作过程至少需要三种工具，即准确切割DNA的“手术刀”、将DNA片段再连接起来的“缝合针”、将体外重组好的DNA导入受体细胞的“运输工具”。科学家已经找到并运用了这三种必需的工具，才使培育抗虫棉这一奇妙构想变成了现实。
限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
切割DNA的工具是限制性核酸内切酶(restrictionendonucleases),又称限制酶(restriction enzyme)。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。迄今已从近300种不同的微生物中分离出了约4000种限制酶。它们能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，例如，EcoRI、SmaI 限制酶识别的序列均为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识別序列的中心轴线（图中虚线）两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。
生物技术资料卡：限制酶的名字怎么起？
限制酶的名字是怎么起的呢？是用生物属名的头一个字母与种名的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪个生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌(Escherichia coli)的R型菌株分离来的，就用字母 EcoR 表示；如果它是从大肠杆菌R菌株中分离出来的第一个限制酶，则进一步表示成 EcoRl。
DNA连接酶——"分子缝合针”
将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA连接酶来完成的。1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够将两条DNA链连接起来的酶，称之为DNA连接酶(DNA ligase)。根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为 E·coli DNA 连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为 T4 DNA 连接酶。这两类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，但这两种酶的作用有所差别：E·coli DNA 连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而 T4 DNA 连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
用什么方法才能将外源基因送入细胞中呢？通常是利用质粒（pla *** id）作为载体（vector）,将基因送人细胞中。质粒是一种 *** 的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。质粒DNA分子上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ\lambda噬菌体的衍生物、动植物病毒等。它们来源不同，在大小、结构、复制以及插入片段大小上也有很大差别。这些基因工程载体的作用，就相当于一种运输工具，因此将它们比喻为“分子运输车”。
在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导人受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
目的基因的获取
获取目的基因是实施基因工程的第一步。目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成。目的基因主要是指编码蛋白质的基因，例如，与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因，以及与工业所需用酶相关的基因等，也可以是一些具有调控作用的因子。
随着科学技术的发展，获取目的基因的方法也越来越多，目前常用的方法有以下几种。
从基因文库中获取目的基因
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分別含有这种生物的不同的基因，称为基因文库（gene library）。基因文库就像一座图书馆，每一个基因就是一本书。如果一座“图书馆”中包含了一种生物所有的基因，那么，我们就可以说这个基因文库很大，就像国家图书馆，这种基因文库叫做基因组文库(genomic library)。也有一些基因文库比较小，就像某个市或某个单位的图书馆，只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，如cDNA文库。怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？这还是一件比较复杂的事情，简单地说就是根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA,以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
基因文库的构建
将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。两种基因文库的主要区别如下表所示。
利用PCR技术扩增目的基因
PCR是多聚酶链式反应（polymerase chain reaction）的缩写。这项技术是由穆里斯等人于1988年发明的，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。
PCR 的原理和做法并不难，它是利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。扩增的过程是：目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物同样可以和引物结合，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n2^n，其中n为扩增循环的次数)。上述过程可以在PCR扩增仪中自动完成。
此外，如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
基因表达载体的构建
基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。因此，一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子(promoter)、终止子(terminater)以及标记基因等。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为这种基因。
另外，由干受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建上也会有所差别，不可能是千篇一律的。
将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化(transformation)。用什么方法将目的基因导入受体细胞呢？目前已开发出来的方法有很多种，每种方法都有其利弊，适合于不同的受体细胞。究竟选用哪种方法，要根据具体情况而定。下列介绍几种常用的转化方法。
将目的基因导入植物细胞
将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法。农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进人植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。由于这种方法比较经济和有效，迄今为止，约80%的转基因植物都是通过这种方法获得的。除此之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。
基因枪法
基因枪法（particle gun）又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。常用的金属颗粒有钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在 0.6~4 μm。这是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。
花粉管通道法
这是我国科学家独创的—种方法。我们知道，植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，花粉管通道法是一种十分简便经济的方法。
将目的基因导入动物细胞
迄今为止，显微注射技术是转基因动物中采用最多，也是最为有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法。1982年，世界上第一例体型比普通小鼠约大一倍的转基因“超级小鼠”就是采用显微注射技术获得成功的。基本的操作程序是：首先将含有目的基因的表达载体提纯，并使DNA浓度保持在1~3μg/mL;然后，从雌性动物体内取出卵（卵可以在体内受精，也可以在体外受精），采用显微注射仪进行显微注射；再将注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养一段时间后，再移植到雌性动物的输卵管或子宫内，使其发育成为具有新性状的动物。
将目的基因导入微生物细胞
由于原核生物具有一些其他生物没有的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等，因此，早期的基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
目的基因的检测与鉴定
目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作，也是检査基因工程是否做成功的一步。
首先，要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键。检测方法是采用DNA分子杂交技术，即将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，就表明目的基因已插人染色体DNA中。
其次，还需要检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。检测方法同样是采用分子杂交技术，与上述方法不同之处是从转基因生物中提取的是mRNA，同样用标记的目的基因作探针，与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA。
最后，检测目的基因是否翻译成蛋白质。检测的方法与上述方法有所不同，是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。
除了上述的分子检测外，有时还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。又如，有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。
1983年，美国某基因公司的一名科学家提出了蛋白质工程这一名词。随着分子生物学、晶体学以及计算机技术的迅猛发展，蛋白质工程已取得了很大的进展。目前，它已成为研究蛋白质结构和功能的重要手段，并将广泛应用于制药和其他工业生产中。
蛋白质工程崛起的缘由
为什么要进行蛋白质工程的研究呢？我们知道，将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状，这就是基因工程的实质。基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的,它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。例如，干扰素是动物体内的一种蛋白质，可以用于治疗病毒的感染和癌症，但在体外保存相当困难。如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，那么在-70℃的条件下，可以保存半年。又如，前面我们提到玉米中赖氨酸的含量比较低，原因是赖氨酸合成过程中的两个关键酶——天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖氨酸浓度的影响较大，当赖氨酸浓度达到一定量时，就会抑制这两种酶的活性。所以赖氨酸含量很难提高。如果我们将天冬氨酸激酶的第352位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶中104位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸分别提高5倍和2倍。还有许多工业用酶也是在改变天然酶的特性后，才使之适应生产和使用需要的。
蛋白质工程的基本原理
蛋白质工程是怎样进行的呢？蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。由于基因决定蛋白质，因此，要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过基因来完成。
我们知道，天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的：基因→表达（转录和翻译）→形成氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能；而蛋白质工程却与之相反，它的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）。
通过以上分析和讨论可以看出，蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。
蛋白质工程的进展和前景
蛋白质工程取得的进展向人们展示出诱人的前景。例如，科学家通过对胰岛素的改造，已使其成为速效型药品。如今，生物和材料科学家正积极探索将蛋白质工程应用于微电子方面。用蛋白质工程方法制成的电子元件，具有体积小、耗电少和效率髙的特点，因此有极为广阔的发展前景。
蛋白质工程是一项难度很大的工程，目前成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，这种高级结构十分复杂，而目前科学家对大多数蛋白质的高级结构的了解还很不够，要设计出更加符合人类需要的蛋白质还需经过艰辛的探索。我们相信，随着科学技术的深入发展，蛋白质工程将会给人类带来更多的福音。
专题小结
基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的理论与技术的基础上，发展起来的一门科学技术。它的应用领域十分广泛，既可以作为研究许多基础理论的一种手段，也可以利用此项技术创造出更符合人类需要的产品，解决常规方法不能解决的许多问题。
基因工程是一种DNA操作技术，需要借助限制酶、连接酶以及载体等工具才能进行。基因工程的基本操作程序是：首先通过不同的方法得到人们所需要的目的基因，然后将目的基因与基因表达所需要的多种元件组装起来构成一个表达载体，再将表达载体导入受体细胞，并使目的基因整合到受体细胞的DNA上，从而培育出转基因生物。
基因工程在植物、动物、微生物等生物上都得到了成功的运用，创造出了许多优良品种或产品。
基因工程是一种新鲜事物，也是一把“双刃剑”，人们对此自然会有不同看法。只要科学地、合理地加以利用，相信基因工程一定会使我们的生活更美好。
基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，这些蛋白质不一定完全符合人类生产和生活的需要。因此，在基因工程基础上产生了蛋白质工程，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
